W Alcalá de Henares Sepúlveda otrzymał stypendium naukowe, co umożliwiło mu kontynuację edukacji we Włoszech, gdzie kształcił się pod kierunkiem tamtejszych humanistów.
Przeniósł się do Bolonii, gdzie w 1515 roku podjął naukę w Kolegium Hiszpańskim. W tym okresie biegle opanował język łaciński. Kształcił się u filozofa Pietra Pomponazziego. Pod wpływem mentora podjął badania nad filozofią Arystotelesa i rozpoczął tłumaczenie na łacinę jego Polityki. Mieszkając w Bolonii, poznał m.in. Alberta Pia, Alda Manuzia, papieża Hadriana VI oraz jego następcę Klemensa VII. Studia w Kolegium Hiszpańskim ukończył z podwójnym doktoratem z teologii i sztuk wyzwolonych. W tym czasie zdobył uznanie w europejskich kręgach naukowych jako znawca filozofii antycznej.
Po ukończeniu studiów w 1523 roku przeniósł się do Rzymu, gdzie podjął pracę jako wykładowca filozofii moralnej na papieskim wydziale teologicznym. W 1527 roku był tam świadkiem gwałtownych wydarzeń zbrojnych, zwanych Sacco di Roma – zdobycia i złupienia miasta przez wojska niemiecko-hiszpańskie pod dowództwem Karola V. Wobec zagrożenia dalszymi zamieszkami Sepúlveda schronił się w Neapolu, skąd powrócił do Rzymu w 1528 roku. Przybył tam w towarzystwie kardynała Francisca de Quiñonesa, z którym pośredniczył w rokowaniach pokojowych między Karolem V a papieżem Klemensem VII.