Przebieg masakry thumb|Tablice na więziennym murze, upamiętniające ofiary masakry Z wykazów odnalezionych w sowieckich archiwach wynika, że stan osadzonych w dubieńskim więzieniu na dzień 10 czerwca 1941 roku wynosił 816 osób. Inne dokumenty NKWD z czerwca 1941 roku, dotyczące niedoszłej do skutku ewakuacji więzienia, podają natomiast, że ewakuacją planowano objąć 696 lub 738 więźniów. Z kolei w ocenie Bogdana Musiała na krótko przed rozpoczęciem niemieckiej inwazji w celach przebywało około 600 więźniów. Byli to w większości Ukraińcy i Polacy, zazwyczaj mieszkańcy powiatów dubieńskiego i krzemienieckiego oraz południowej części powiatu zdołbunowskiego.
Na wieść o wybuchu wojny Sowieci zaciemnili gmach więzienia, zwiększyli liczbę wartowników w jego najważniejszych punktach, a także zaostrzyli dyscyplinę, m.in. wstrzymując spacery. Od godzin porannych 22 czerwca więźniom nie wydawano już posiłków. Dubno znajdowało się na głównym kierunku niemieckiego natarcia, stąd NKWD rozpoczęło masową likwidację więźniów już w nocy z 23 na 24 czerwca. Ze względu na szybkie postępy wojsk niemieckich masakrę przeprowadzono w sposób bardzo pośpieszny, nie dbając o zatarcie jej śladów i ukrycie zwłok. Enkawudziści chodzili od celi do celi, poczynając od parteru, rozkazując więźniom, aby ustawili się w szeregu naprzeciw drzwi.