Dużo większa inwazja Turków osmańskich nastąpiła w roku 1565. Znana jest jako Wielkie Oblężenie Malty. Podczas oblężenia flota turecka bazowała w Marsamxett, a armaty zostały ustawione na Tigné Point, celem bombardowania Fortu Saint Elmo. Podczas ataku zginął turecki admirał Turgut, zabity przez zabłąkane pociski. Oblężenie zostało przetrzymane i Zakon oraz Maltańczycy wyszli z opresji zwycięsko. Na półwyspie Sciberras zbudowane zostało nowe miasto, nazwane Valletta na cześć Wielkiego Mistrza, który je ufundował. Później zbudowane zostało przedmieście Valletty - Floriana, które jest teraz samodzielnym miastem na swych własnych prawach.
W roku 1592, na Manoel Island, znanej wówczas jako l'Isola del Vescovo, zbudowany został drewniany szpital-kwarantanna. Został on rozebrany już rok później, lecz stały budynek Lazzaretto został postawiony na tym samym miejscu w roku 1643, i będąc kilkakrotnie ulepszany, służył do roku 1929.
W latach 1723–1733 na Wyspie Manoela zbudowany został Fort Manoel, a w roku 1793 na Tigné Point zbudowano Fort Tigné. Brytyjczycy zbudowali na Tigné Point koszary, lecz zostały one później zburzone.