Leptospiry można izolować do hodowli, zgodnie z przebiegiem zakażenia, najpierw z krwi oraz płynu mózgowo-rdzeniowego, a później z moczu, gdzie są obecne nawet do 3 miesięcy. W związku z tym, że ilość leptospir w krwi oraz płynie mózgowo-rdzeniowym jest niewielka, zaleca się, by do oceny pobierać kilka próbek. Obecne we krwi oraz w moczu inhibitory wzrostu mogą znacząco opóźniać lub z całkowicie uniemożliwić izolację bakterii. Pobrany mocz musi przed badaniem zostać zneutralizowany, do uzyskania obojętnego pH, a następnie zagęszczony poprzez proces odwirowania. Na podłoże nanosi się kilka kropel osadu z obrobionego moczu. Wzrost kolonii jest kontrolowany przez mikroskop z ciemnym polem widzenia.
Diagnostyka molekularna Badania mające na celu wykrycie leptospir w materiale pobranym za pomocą sond molekularnych od chorych mają małą przydatność.
Techniki amplifikacji kwasów nukleinowych, mimo że są skuteczniejsze, nie są obecnie dostępne do rutynowej diagnostyki. Do metod tych zalicza się m.in. PCR.