24 marca 1882 Koch ogłosił, że wyodrębnił bakterię wywołującą gruźlicę (prątek Kocha). W 1890 wykorzystując zabite prątki gruźlicy uzyskał tuberkulinę i sądził, że znalazł lekarstwo na tę chorobę. Preparat jako lek był nieskuteczny, ale okazał się ogromnie przydatny w diagnostyce gruźlicy (próba tuberkulinowa). Aż do 1903 Koch badał naturę gruźlicy oraz metody jej leczenia w szpitalu im. Augusta Hohenlohe w Sławięcicach. W 1905 za prace nad gruźlicą otrzymał Nagrodę Nobla.

Koch, obok Ludwika Pasteura, był jednym z twórców mikrobiologii lekarskiej. Udoskonalił techniki badań bakteriologicznych, wprowadzając nowe metody hodowli kultur bakterii na żelatynie oraz nowy sposób ich barwienia. W 1892 sformułował zbiór reguł diagnostycznych, znanych jako postulaty Kocha, pozwalających określić, czy dany mikroorganizm rzeczywiście jest czynnikiem chorobotwórczym.

Kierował badaniami nad cholerą (w 1883 potwierdził, że przecinkowiec cholery faktycznie wywołuje tę chorobę), malarią, biegunką, jaglicą, tyfusem, dżumą oraz różnymi chorobami bydła, m.in. zarazą bydlęcą i gorączką teksaską. Opracował metodę sterylizacji z wykorzystaniem pary wodnej, niszczącej formy przetrwalnikowe wąglika (aparat Kocha).