thumb|Xel d'agarosa tiñíu con bromuru de etidio qu'amuesa dellos productos de PCR llograos por aciu l'usu de distintos cebadores, que presenten un baxu nivel d'especificidá.
La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR poles sos sigles n'inglés (polymerase chain reaction), ye una téunica de bioloxía molecular desenvuelta en 1983 por Kary Mullis.Bartlett & Stirling (2003)—A Short History of the Polymerase Chain Reaction. In: Methods Mol Biol. 226:3-6El so oxetivu ye llograr un gran númberu de copies d'un fragmentu d'ADN particular, partiendo d'un mínimu; en teoría basta partir d'una única copia d'esi fragmentu orixinal, o molde.History of Polymerase Chain Reaction (PCR)
Esta téunica sirve p'amplificar un fragmentu d'ADN; la so utilidá ye que tres l'amplificación resulta muncho más fácil identificar con una bien alta probabilidá, virus o bacteries causantes d'una enfermedá, identificar persones (cadabres) o faer investigación científica sobre l'ADN amplificáu. Estos usos derivaos de l'amplificación fixeron que se convierta nuna téunica bien estendida, sobre manera nel ámbitu de la investigación forense, col consiguiente abaratamientu del equipu necesariu pa llevar a cabu dicha téunica.
Fundamentu ya importancia Esta téunica encontar na propiedá natural de los ADN polimerasas pa retrucar hebras d'ADN, pa lo cual empléguense ciclos d'altes y baxes temperatures alternaes pa dixebrar les hebras d'ADN recién formaes ente sigo tres cada fase de replicación y, de siguío, dexar que les hebras d'ADN vuelvan xunise pa poder doblales nuevamente. La reacción en cadena de la polimerasa foi perfeccionada por Kary Mullis perteneciente a la Cetus Corporation en California, na década de 1980. Primeramente la téunica yera lenta, una y bones les polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambeos de temperatura y yera necesariu amestar nueves polimerasas en cada ciclu. Yá que les temperatures del ciclu (95 °C nes fases de desnaturalización del ADN) suponen la inmediata desnaturalización de toa proteína, empléguense ADN polimerasas termoestables, estrayíes de microorganismos afechos a vivir a eses temperatures, restrictives pa la mayoría de los seres vivos. Dichos microorganismos, xeneralmente arquies, son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus thermophilus (Tth). Xeneralmente empléguense amiestos de polimerasas bien procesivas (Taq) con otres capaces de faer correición d'errores (Pfu, Vent).
thumb|Termociclador: aparatu nel que s'efectúa la PCR convencional. Güei, tol procesu de la PCR ta automatizado por aciu un aparatu llamáu termociclador, que dexa calecer y esfrecer los tubos de reacción pa controlar la temperatura necesario pa cada etapa de la reacción. Munchos termocicladores modernos faen usu del efeutu Peltier, que dexa tanto calecer como esfrecer los tubos a cencielles invirtiendo la corriente llétrica. Los tubos usaos pa PCR tienen una paré bien fina, lo que favorez una bona conductividá térmica, dexando que s'algame rápido'l equilibriu térmicu. Casi tolos termocicladores tienen un sistema que calez la tapa de zarru col fin d'evitar la condensación sobre los tubos de reacción. Los termocicladores más antiguos escarecíen d'esti sistema y solucionaben el problema de la condensación con una capa d'aceite na parte cimera del amiestu de reacción o con un pocu de cera dientro de los tubos. Anguaño esisten dellos termocicladores qu'utilicen o pueden utilizar aceite mineral nel tubu de PCR como los termocicladores de nueva xeneración de fluxu de aíre.
Polo xeneral, la PCR ye una téunica común y de normal indispensable en llaboratorios d'investigación médica y biolóxica pa una gran variedá d'aplicaciones. Ente elles inclúyense la clonación d'ADN pa la secuenciación, la filoxenia basada n'ADN, l'analís funcional de xenes, el diagnósticu de trestornos hereditarios, la identificación de buelgues xenétiques (usada en téuniques forenses y test de paternidá) y la detección y diagnósticu d'enfermedaes infeicioses.
Reactivos thumb|Tubos de PCR qu'alluguen l'amiestu nun volume total de 100 μL. Pa realizar la téunica precísense:
Los 4 desoxirribonucleótidos-trifosfato (dNTP), sustratos para polimerizar nuevu ADN. Dos cebadores o iniciadores (n'inglés, primers), oligonucleótidos que son, cada unu, complementarios a una de los dos hebras del ADN. Son secuencies curties, d'ente seis y cuarenta nucleótidos, de normal de dieciocho a ventidós, que dexen que la polimerasa empecipie la reacción. Tienen De tar engarraos y non a muncha distancia. Delimitan la zona d'ADN a amplificar, esto ye, correspuenden a los nucleótidos que definen los estremos de la secuencia que se desea retrucar. Iones divalentes. Suelse usar magnesiu (Mg2+), amestáu comúnmente como cloruru de magnesiu (MgCl2), o dalgún otru catión divalente. Tamién puede emplegase manganesu (Mn2+), para mutagénesis d'ADN por aciu PCR, yá que altes concentraciones de Mn2+ amonten la tasa d'error mientres la síntesis d'ADN. Actúen como cofactores de la polimerasa. Iones monovalentes, como'l potasiu. Una solución tampón o buffer que caltién el pH fayadizu pal funcionamientu de l'ADN polimerasa. ADN polimerasa o amiestu de distintes polimerasas con temperatura óptima alredor de 70 °C (la más común ye la polimerasa Taq). ADN molde, que contién la rexón d'ADN que se va a amplificar. Termociclador, l'aparatu que caltién la temperatura necesario en caúna de les etapes que conformen un ciclu.
Conceutos de la PCR Sensibilidá: referir a la cantidá mínima d'ADN necesaria por que se produza l'amplificación, esto ye, pa llograr una banda. Rellacionar colos falsos negativos, yá que pue que una muestra sía positiva pero sía dada como negativa porque nun s'amplificó por non tener abonda cantidá d'ADN.
Especificidá: referir al llogru d'un solu productu amplificáu. Vien determinada polos oligos y l'especificidá cola que se xunen al ADN molde. D'esta forma, si los oligos tienen más d'un sitiu al que pueden xunise va apaecer más d'un productu amplificáu. Rellacionar colos falsos positivos, yá que pue que una muestra sía negativa pero sía dada como positiva porque s'amplificó una rexón d'ADN non diana o que nun se buscaba amplificar.
Eficiencia: referir a l'amplificación máxima que puede llograse nun númberu determináu de ciclos.
Fidelidá: referir a los errores que comete l'ADN polimerasa mientres l'amplificación. Esti conceutu ye d'especial importancia na secuenciación, pero n'otros casos nun ye tan importante. Una bona fidelidá dexa evitar falsos positivos y/o negativos.
Ciclu d'amplificación thumb|300px|Esquema xeneral de la PCR. thumb|300px|Grau d'amplificación según el númberu de ciclos emplegaos. A: xel de agarosa (1: ladder, 2: productu específicu, 3: productu inespecíficu); B concentración d'ADN respeuto del tiempu; C llogaritmu de la concentración d'ADN respeuto del tiempu. El procesu de PCR polo xeneral consiste nuna serie de 20 a 35 cambeos repitíos de temperatura llamaos ciclos; cada ciclu suel consistir en 2-3 pasos a distintes temperatures. La PCR común realizar con ciclos que tienen tres pasos de temperatura. Los pasos de ciclos de cutiu tán precedíos por un choque térmicu (llamáu "hold") a alta temperatura (> 90 °C), y siguíu por otru hold a la fin del procesu pa la estensión de productu final o'l curtiu almacenaxe. Les temperatures usaes y el tiempu aplicáu en cada ciclu dependen de gran variedá de parámetros. Estos inclúin la enzima usada pa la síntesis d'ADN, la concentración d'iones divalentes y de los dNTP na reacción, y la temperatura d'unión de los cebadores, según el llargor del ADN que se desea amplificar.
Anguaño, casi tolos termocicladores dan la opción de realizar la reacción de PCR cola llamada " tapa caliente". Esto ye, que'l sistema del termociclador va aplicar calor a la parte de riba del vial que contién l'amiestu de PCR. Al empiezu, los llaboratorios qu'empezaron a usar los primeros aparatos que se comercializaron y que nun incluyíen esti sistema teníen que poner unes gotes d'aceite dientro del vial. L'oxetivu d'esti procedimientu, al igual que'l de la tapa caliente, ye evitar la condensación de la muestra, yá que nel eppendorf atópense dos fases:líquidu y gas. Al entestase la muestra, perdemos volume del amiestu. Sicasí, caleciendo la tapa o poniendo les gotes d'aceite evitamos esti procesu físicu, calteniendo casi intactu'l volume de la muestra.
Entamu Esti pasu consiste en llevar la reacción hasta una temperatura de 94-96 °C (ó 98 °C si ta usándose una polimerasa termoestable estrema), que se caltién mientres 1-9 minutos. Esto namái ye necesariu para ADN polimerasas que rican activación por calor.
Desnaturalización De primeres, se desnaturaliza l'ADN (dixébrense les dos cadenes de les cualos ta constituyíu). Esti pasu puede realizase de distintes maneres, siendo'l calentamientu (94-95 °C) de la muestra la forma más habitual. La temperatura a la cual decide realizase la desnaturalización depende, por casu, de la proporción de G+C que tenga la cadena, como tamién de la llongura de la mesma. Otros métodos, raramente emplegaos na téunica de la PCR, seríen la adición de sales o axentes químicos capaces de realizar la desnaturalización.
Alliniadura o unión del cebador De siguío va producise la hibridación del cebador, esto ye, el cebador va xunir a la so secuencia complementaria nel ADN molde. Pa ello ye necesariu baxar la temperatura a 40-68 °C mientres 20-40 segundos (según el casu), dexando asina l'alliniadura. Los puente d'hidróxenu estables ente les cadenes d'ADN (unión ADN-ADN) namái se formen cuando la secuencia del cebador ye bien similar a la secuencia del ADN molde. La polimerasa xune l'híbridu de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los cebadores van actuar como llendes de la rexón de la molécula que va ser amplificada.
Estensión o elongación de la cadena Actúa la polimerasa, tomando l'ADN molde pa sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesariu pa la síntesis de nuevu ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra d'ADN complementaria a la hebra molde añadiendo los dNTP complementarios en direición 5'→ 3', xuniendo'l grupu 5'-fosfatu de los dNTP col grupu 3'-hidroxilo del final de la hebra d'ADN creciente (la cual estiéndese). La temperatura pa esti pasu depende del ADN polimerasa qu'usemos. Pa la polimerasa Taq, la temperatura de máxima actividá ta en 75-80 °C (comúnmente 72 °C). El tiempu d'estensión depende tantu del ADN polimerasa usada como del llargor del fragmentu d'ADN que se va a amplificar. Hai una regla comúnmente usada: na so temperatura óptima, la polimerasa d'ADN polimerizará mil bases nun minutu.
Elongación final Etapa única que se lleva a cabu a una temperatura de 70-74 °C mientres 5-15 minutos tres l'últimu ciclu de PCR. Con ella asegúrase que cualquier ADN de cadena simple restante sía totalmente ampliáu.
Caltenimientu Este ye un pasu que se lleva a cabu a 4-15 °C mientres un tiempu indefiníu pa caltener la reacción al curtiu plazu.
La PCR de normal realízase con un volume de reacción de 15-100 μL, en pequeños tubos de 0.2-0.5 mL que s'asitien nel termociclador.
Pa verificar que la PCR xeneró'l fragmentu d'ADN previstu, empléguense téuniques d'electroforesis, que dixebren los fragmentos d'ADN xeneraos d'alcuerdu a la so carga, esto ye, llargor, y, en menor midida y dependiendo de la matriz emplegada, al so tamañu: típicamente empléguense la electroforesis en xel de agarosa, pa fragmentos grandes; n'acrilamida, pa los más pequeños; y, de forma más rápida y aplicable a la PCR acomuñada a marcaje fluorescente, la electroforesis capilar. El/los tamañu/s de los productos de la PCR vienen determinaos por un marcador de pesu molecular d'ADN, que contién fragmentos d'ADN de tamañu conocíu, y que se cuerre nel xel xunto colos productos de PCR.
Optimización de la PCR