Krebsov ciklus ili ciklus limunske kiseline i ciklus trikarboksilnih kiselina (TCA ciklus) je jedan od temeljnih metaboličkih ciklusa u ćelijama koje se koriste kisikom u procesu ćelijskog disanja. Kod aerobnih organizama, ovaj ciklus je integrirajući metabolički proces koji spaja puteve degradacije (katabolizma) ugljikohidrata, lipida (masti) i bjelančevina u ugljik-dioksid i vodu, uz oslobađanje određenih količina hemijske energije.
Ciklus limunske kiseline je anfibolički metabolički put, jer sudjeluje i u degradaciji organskih molekula (katabolizam) i u njihovoj biosintezi (anabolizam). Najvažniji metabolički putevi koji se vežu na Krebsov ciklus su prethodna glikoliza i oksidativna dekarboksilacija piruvata i naredna oksidativna fosforilacija. Krebsov ciklus je važan i kao izvorni oblik pri nastanku aminokiselina (acetil CoA, α-ketoglutarat, sukcinil CoA, sukcinat, fumarat, oksalacetat).
Ciklus nosi ime po Hansu Adolfu Krebsu, britanskom biologu njemačkog porijekla koji je otkrio ključne elemente procesa limunske kiseline i za to dobio Nobelovu nagradu za medicinu 1953.Hall J. E., Guyton A. C. (2006): Textbook of medical physiology, 11th edition. Elsevier Saunders, St. Louis, Mo, .Međedović S., Maslić E., Hadžiselimović R. (2000): Biologija 2. Svjetlost, Sarajevo, .Bajrović K, Jevrić-Čaušević A., Hadžiselimović R., Ed. (2005): Uvod u genetičko inženjerstvo i biotehnologiju. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo, .Kornberg A. (1989): For the love of enzymes – The Odyssay of a biochemist. Harvard University Press, Cambridge (Mass.), London,, .Hunter G. K. (2000): Vital Forces. The discovery of the molecular basis of life. Academic Press, London 2000, .
Osnovne reakcije Krebsov ciklus se odvija u mitohondrijama eukariotskih i citoplazmi prokariotskih ćelija. Katabolizam ugljikohidrata i masti stvara acetil-CoA – molekulu sastavljenu od jedne acetilne grupe koja je vezana na koenzim A. Acetil-CoA je osnovni supstrat Krebsovog ciklusa. Dvije molekule acetil-CoA oslobađaju svoje acetilne grupe, koje se spajaju s oksalacetatom i čine limunsku kiselinu. Ona prolazi kroz niz metaboličkih procesa, oslobađajući dvije molekule ugljendioksida (CO2) i ponovo se obnavlja u oksalacetat koji je spreman za naredni ciklus. U bioenergetici tog procesa, najbitnije su reakcije stvaranja molekule guanozin trifosfata (GTP), koja odmah obnavlja jednu molekulu adenozin-trifosfata (ATP) i nastanak tri molekule nikotinamid adenin dinukleotida (NADH) i jedne flavin adenin dinukleotida (FADH2). Ključne hemijske reakcije i uključeni enzimi u Krebsovom ciklusu, kao i njihovi glavni proizvodi prikazani su u tabeli koja slijedi.Barnes S. J., Weitzman P. D. (1986): Organization of citric acid cycle enzymes into a multienzyme cluster. FEBS Lett., 201 (2): 267–270.
Reducirani kofaktori NADH i FADH2 su prijelazne molekule u procesima oksidacije i redukcije. U reduciranom obliku prenose elektrone sa oksidiranih molekula iz samog Krebsovog ciklusa i glikolize na molekule prve faze oksidativne fosforilacije, tzv. lanca prijenosa elektrona. Tada se oksidiraju u NAD+ i FAD i daju elektrone, koji će se, tokom oksidacijske fosforilacije, iskoristiti za obnavljanje ATP iz adenozin-difosfata (ADP).Berg J. M., Tymoczko J. L., Stryer L. (2002): Biochemistry, 5th edition. W. H. Freeman and Company, . –
Konačna stehiometrijska formula svih reakcija je kako slijedi:
Dobijena energija od potpune razgradnje jedne molekule glukoze, u tri faze ćelijskog disanja (glikoliza, Krebsov ciklus i oksidativna fosforilacija) izbnosi 36 molekula ATP. Ukupno nastaje 38 molekula ATP, ali dvije su iskorištene za prijenos (aktivnim transportom) dviju molekula NADH proizvedenih glikolizom iz citoplazme kroz membranu mitohondrija.
center|Ciklus limunske kiseline
Supstrat Koenzim Enzim Vrsta reakcije Inibitori Aktivatori Produkt 1 Oksalacetat Acetil-CoA, voda Citrat sintetaza Kondenzacija Citrat, NADH, sukcinil-CoA – Citrat 2a Citrat – Akonitaza Dehidracija – – Cis-akonitat, voda 2b Cis-akonitat Voda Hidracija Izocitrat 3a Izocitrat NAD+ Izocitrat dehidrogenaza Oksidacija NADH, ATP Ca2+, ADP Oksalsukcinat, NADH 3b Oksalsukcinat H+ Dekarboksilacija α-Ketoglutarat, CO2 4 α-Ketoglutarat NAD+, CoA-SH α-Ketoglutarat dehidrogenaza Oksidativna dekarboksilacija NADH, sukcinil-CoA Ca2+ Sukcinil-CoA, NADH, CO2 5 Sukcinil-CoA GDP, fosfat sukcinil-CoA sintetaza Fosforilacija – – Sukcinat, GTP, CoA-SH 6 Sukcinat FAD Sukcinat deihdrogenaza Oksidacija – – Fumarat, FADH2 7 Fumarat Voda Fumaraza Hidracija – – L-malat 8 L-malat NAD+ Malat dehidrogenaza Oksidacija – – Oksalacetat, NADH
Reakcije u Krebsovom ciklusu thumb|Svaka podjedinica citrat sintetaze veže jednu molekulu oksalacetata (ljubičasto) i jednu acetil-CoA (sivo). Reakcija 1: Citrat sintetaza mini|300px|Citratna reakcija oksalacetat-AcCoA: ΔG'°=-31.4 kJ/mol mini|Struktura akonitaze Prvi enzim u Krebsovom ciklusu, citrat sintetaza – katalizira reakciju kondenzacije acetil-CoA s oksalacetatom iz kojeg nastaje citrat (limunska kiselina). Enzim ima dvije strukturne podjedinice, od kojih je svaka sposobna vezati oba supstrata za svoje aktivno mjesto.Nelson D. L., Cox M. M. (2013): Lehninger Principles of Biochemistry. W. H. Freeman and Co., .Kapur Pojskić L., Ed. (2014): Uvod u genetičko inženjerstvo i biotehnologiju, 2. izdanje. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo, .
Ovaj enzim katalizira aktivaciju acetil-CoA, kako bi se povećala sklonost prema oksalacetatu. Nakon vezanja acetilne skupine za oksalacetat, tioesterna se grupa (CoA) odvaja hidrolizom i oslobađa se limunska kiselina.
Jednadžba reakcije: Acetil-CoA + oksakacetat + H2O → citrat + CоА + H+
Reakcija je vrlo egzoergonska tj. oslobađa energiju (ΔG'°=-31.4 kJ/mol) što sprečava da reakcija teče u suprotnom smjeru. Pored toga, limunska kiselina podešava aktivnosti samog enzima, jer djeluje kao kompetitivni inhibitor. Sposobnost inhibicije citrat sintetaze je veoma bitna za podešavanje cijelog Krebsovog ciklusa, pošto ona djeluje kao biohemijski regulator ritma (pacemaker).Usher C, Remington J., Martin P., Drueckhammer G. (1994): A very short hydrogen bond provides only moderate stabilization of an enzyme-inhibitor complex of citrate synthase. Biochemistry 33, S. 7753.-7759.
Reakcija 2: Akonitaza thumb|350px|Reakcija citrat - izocitrat: ΔG'°=+6.3 kJ/mol Akonitaza katalizira izomerizaciju citrata u izocitrat preko prijelaznog cis-akonitata. Citrat zatim ulazi u proces dehidracije ugljika C3 i stvaranje međuspoja cis-akonitata, koji se zatim hidrira u C2 i stvara izocitrat. Reakcija može teći i povratno − u suprotnom smjeru, ali to se ne događa u Krebsovom ciklusu zbog zakona o djelovanju masa. Koncentracija citrata je 91%, međuspoja cis-akonitata: 3%, a izocitrata: 6%. Reakcija zato teče nepovratno prema izocitratu.
Jednadžba reakcije: citrat → cis-akonitat + H2O → izocitrat
U aktivnom mjestu akonitaze se nalazi grupa željezo-sumpor koja veže supstrat, zajedno s određenim polarnim aminokiselinama. Prostorna struktura aktivnog mjesta omogućava samo vezanje 1R,2S citrata, odbijajući suprotni izomer.
250px|thumb|Struktura izocitrat dehidrogenaze Escherichia coli.
Reakcija 3: Izocitrat dehidrogenaza thumb|300px|Reakcija izocitrat - oksoglutarat: ΔG'°=-8.4 kJ/mol Mitohondrijska izocitrat dehidrogenaza je enzim koji je ovisan o NAD+, Mn2+ i/ili Mg2+. U početku enzim katalizira oksidaciju izocitrata u oksalsukcinat i, od NAD+, proizvodi jednu molekulu NADH. Nakon toga, jedan bivalentni ion (Mn2+ ili Mg2+) veže kisik iz karboksilne skupine i povećava elektronegativnost tog dijela molekule. Molekulski elektroni se preraspodijele, hemijske veze se kidaju i karboksilne grupe oslobađaju. Dekarboksilacijom se stvaraju α-ketoglutarata i oslobađa jedna molekula CO2.Mesecar A.D., Stoddard B.L., Koshland Jr. D.E. (1997): Orbital steering in the catalytic power of enzymes: small structural changes with large catalytic consequences. Science v, 277: 202-206.
Jednadžba reakcije: izocitrat + NAD+ → Oksalsukcinat + NADH + H+; Oksalsukcinat → α-ketoglutarat + CO2
thumb|250px|Aktivno mjesto dihidrolipoamid sukciniltransferaze – enzima α-ketoglutarat deihdrogenaze Escherichia coli
Reakcija 4: α-ketoglutarat dehidrogenaza thumb|300px|Reakcija oksoglutarat - sukcinil CoA: ΔG'°=-30.1 kJ/mol thumb|250px|Struktura sukcinil-CoA sintetaze izolirane iz svinjskog srčanog mišića
Transformacija α-ketoglutarata u sukcinil-CoA pomoću α-ketoglutarat dehidrogenaze odvija se putem oksidativne dekarboksilacije. Reakcija uključuje dekarboksilaciju α-ketoglutarata i stvaranje tioesterne veze s koenzimom A, uz konačni proizvod sukcinil CoA i oslobađanje CO2. Istovremeno se NAD+ reducira u NADH.
Jednadžba reakcije: α-ketoglutarat + NAD+ + CоА-SH → sukcinil CоА + CO2 + NADH + H+
α-ketoglutarat dehidrogenaza je u biti kompleks sastavljen od tri različita enzima. Podjedinice E1 (2-ketoglutarat dehidrogenaza) i E2 (transsukcinilaza) su vrlo slične podjedinicama u jednom drugom enzimu: piruvat dehidrogenazi. Podjedinica E3, međutim, istovjetna je podjedinici istog enzima. Najvjerovatnije je da jedan enzim evolucijski potiče od drugoga.Knapp J. E. et al. (2000): Expression, purification, and structural analysis of the trimeric form of the catalytic domain of the Escherichia coli dihydrolipoamide succinyltransferase. Protein Sci. v 9. 37-48.
Reakcija 5: Sukcinil CoA sintetaza thumb|300px|Reakcija sukcinil-CoA-sukcinat: ΔG°′ = -3.3 kJ mol-1 Sukcinil CoA je tioester visoke hemijske energije: njegova ΔG°′ hidrolize je -33.5 kJ mol-1, slična onoj ATP -30.5 kJ mol-1. Enzim sukcinil CoA sintetaza uzima ovu energiju za fosforilaciju purinskog nukleozid difosfata kao GDP u jednoj od ključnih reakcija stvaranja hemijske energije iz Krebsovog ciklusa.
Energija u tioesteru se jednostavno pretvori u energiju fosfatnih veza koje se kasnije koriste kao univerzalni izvor energije u gotovo svim endoergonskim metaboličkim procesima cijelog organizma. U prvom koraku reakcije, enzim iz sukcinil CoA uklanja Koenzim A i nastaje međuspoj visoke energije sukcinil fosfat. Potom jedna molekula histidina prima fosfat u aktivnom mjestu enzima koji oslobađa sukcinat, kao konačni proizvod reakcije i izgradnje fosfohistidina. Fosfohistidin odmah prebacuje fosfat na GDP. pretvarajući ga u GTP. To je jedina reakcija u Krebsovom ciklusu u kojoj se fosforilacija odvija na razini substrata.
Jednadžba reakcije: sukcinat-CоА + Pi + GDP → sukcinat + GTP + CоА-SH
GTP kao molekulu visoke energije (GTP ima ulogu signalne molekule), organizam ne koristi direktno. U Krebsovom ciklusu da posluži kao međuspoj koji prebacuje fosfatnu grupu na ADP kako bi se stvorio ATP. Tu reakciju katalizira enzim nukleozid difosfokinaza.
U završnim fazama Krebsovog ciklusa dolazi do preraspodjele molekula s četiri atoma ugljika do ponovne obnavljanja oksalacetata. Da bi to bilo moguće, metilna grupa na sukcinatu mora proći pretvaranje u karbonilnu grupu, koja se odvija u tri prijelazna koraka: prva oksidacija, hidracija, pa druga oksidacija. Osim što obnavljaju oksalacetat, ovi prijelazi omogućavaju izvlačenje dodatne hemijske energije preko flavin adenin FADH2 i NADH.
thumb|250px|Struktura enzimskog kompleksa sukcinat dehidrogenaze i kompleksa II lanca prijenosa elektrona Escherichia coli
Reakcija 6: Sukcinat dehidrogenaza thumb|300px|Reakcija sukcinat-fumarat: ΔG'°=0 kJ/mol thumb|250px|Struktura fumaraze kvasca Saccharomyces cerevisiae
Prvu reakciju oksidacije katalizira enzimski kompleks sukcinat dehidrogenaze, koji je jedini enzim iz ciklusa sa FAD kao akceptorom vodika, umjesto NAD+. FAD je preko jedne molekule histidina kovalentno vezan za enzim, koji rijetko koristi FAD kao primatelja vodika, pošto reakcija ne daje dovoljno slobodne energije da reducira NAD+. Enzim katalizira oksidaciju sukcinata u fumarat.
Jednadžba reakcije: sukcinat+ FAD → fumarat + FADH2