DNK-barkodiranje je taksonomska metoda kojom se koristi kratki genetički marker u DNK organizmima da ih identificira kao pripadnike određene vrste. Razlikuje se od molekularne filogenije po tome što glavni cilj nije da se utvrde obrasci srodnosti, već identifikuju nepoznati uzorci u smislu već postojeće klasifikacije. Iako se bar kodovi ponekad koriste prilikom pokušaja da se identifikuju nepoznate vrste ili u procjenama da li neku određenu vrstu treba kombinovati (sa nekom drugom) ili odvojiti. Primjena DNK kodiranja za ove potrebe je predmet rasprava.
Pregled
Najčešće korištena barkod regija kod životinja je segment veličine oko 600 baznih parova u mitohondrijskom genu citohrom c oksidaze (citohrom c oksidaza I: COI).
Primjena ove metode uključuje, naprimjer, prepoznavanje biljnih ostataka čak i kada cvijet ili plod nisu dostupni, identifikaciju larvi insekata (koji često imaju manje poznatih dijagnostičkih karakteristika od odraslih), identifikaciju ishrane životinja, na osnovu sadržaja stomaka ili izmeta i obezbjeđuje veliku varijaciju između vrsta, a ipak relativno mali broj varijacija u okviru datih vrsta. Primjenjuje se i u identifikaciji komercijalnih proizvoda kao naprimjer, biljni dodaci, drvo ili koža i drugi dijelovi životinja.
Izbor lokusa Poželjno mjesto za DNK barkodiranje treba biti standardizirano (tako da se mogu razviti velike baze podataka za date lokuse), prisutno u većini taksona od interesa i moguće za sekvenciranje bez specifičnih PCR prajmera, a dovoljno kratko da se lahko sekvencira sa sadašnjom tehnologijom.
Iako je predloženo nekoliko lokusa, zajednički skup standardiziranih regija su odabrali nadležni odbori:
Za životinje i mnoge druge eukariote – mitohondrijski COI gen; Za biljke, spajanje na RuBisCO velika podjedinica i maturaza K (matK) hloroplastnog gena. Ove omogućavaju slabu rezoluciju kod kopnenih biljaka, i upućuju na regije koje bi mogle biti zamjena za rbcL i matK.
Za gljive – regija unutrašnji transkribirani spejser (ITS).
thumb|400px| Shema DNK barkodiranja
DNK-barkodiranje jeste metoda identifikacije vrsta korištenjem kratkog dijela DNK iz određenog gena ili više gena. Premisa DNK barkodiranja je da se, poređenjem s referentnom bibliotekom takvih dijelova DNK (također nazvanih "sekvence"), pojedinačna sekvenca može koristiti za jedinstvenu identifikaciju organizma u odnosu na vrstu, baš kao što skener supermarketa koristi poznate crne pruge UPC barkoda za identifikaciju artikla na svom skladištu u odnosu na svoju referentnu bazu podataka. Ovi "barkodovi" koriste se ponekad u nastojanju da se identifikuju nepoznate vrste ili dijelovi organizma, jednostavno da se katalogizira što više taksona ili da se uporedi s tradicionalnom taksonomijom u nastojanju da se odrede granice vrsta.
Različite genske regije se koriste za identifikaciju različitih organizamskih grupa, korištenjem barkodiranja. Najčešće korištena barkodna regija za životinje i neke protiste je dio gena citohrom c oksidaza I (COI, CO1 ili COX1), koji se nalazi u mitohondrijskoj DNK. Drugi geni pogodni za DNK barkodiranje su interni transkribovani razmaknik (ITS) rRNL, koji se često koristi za gljive i RuBisCO koji se koristi za biljke. Mikroorganizmi se detektuju korištenjem različitih genskih regija. Gen 16S rRNK se, naprimjer, široko koristi u identifikaciji prokariota, dok se gen 18S rRNAK uglavnom koristi za detekciju mikrobnih eukariota. Ove genske regije su odabrane jer imaju manje intrspecijskih (unutar vrste) varijacija nego interspecijskih (između vrsta) varijacija, što je poznato kao "barkodirajući gep". Neke primjene DNK barkodiranja uključuju: identifikaciju lišća biljaka, čak i kada cvjetovi ili plodovi nisu dostupni; identifikaciju polena prikupljenog na tijelima životinja oprašivača; identifikaciju larvi insekata koje mogu imati manje dijagnostičkih karakteristika od odraslih; ili istraživanje prehrane životinje na osnovu sadržaja njenog želuca, pljuvačke ili izmeta. Kada se barkodiranje koristi za identifikaciju organizama iz uzorka koji sadrži DNK iz više organizama, koristi se termin DNK metabarkodiranje, e.g. DNA metabarcoding of diatom communities in rivers and streams, which is used to assess water quality.
Pozadina Tehnike DNK barkodiranja razvijene su iz ranog rada na sekvenciranju DNK na mikrobnim zajednicama korištenjem 5S rRNK gena. U 2003., specifične metode i terminologija modernog DNK barkodiranja predložene su kao standardizirana metoda za identifikaciju vrsta, kao i potencijalno dodjeljivanje nepoznatih sekvenci višim taksonima poput redova i koljena, u radu Paula D.N. Heberta i saradnika sa Univerziteta u Guelphu, Ontario, Kanada. Hebert i njegove kolege demonstrirali su korisnost gena za citokrom c oksidaze I (COI), koji su prvi koristili Folmer i saradnici 1994. godine, koristeći svoje objavljene DNK-prajmere kao alat za filogenetske analize na nivou vrsta, kao pogodan alat za razlikovanje između metazojskih beskičmenjaka. "Folmerova regija" gena COI koristi se obično za razlikovanje između taksona na osnovu njihovih obrazaca varijacija na nivou DNK. Relativna lakoća pronalaženja sekvence i varijabilnost pomiješana s očuvanjem između vrsta, neke su od prednosti COI. Nazivajući profile "barkodovima", Hebert i saradnici su zamislili razvoj COI baze podataka, koja bi mogla poslužiti kao osnova za "globalni sistem bioidentifikacije".
Metode Uzorkovanje i konzerviranje Barkodiranje može se izvršiti iz tkiva iz ciljanog uzorka, iz mješavine organizama (uzorak u rasutom stanju) ili iz DNK prisutne u uzorcima iz okoliša (npr. voda ili tlo). Metode uzorkovanja, očuvanja ili analize razlikuju se između tih različitih vrsta uzoraka.
Uzorci tkiva Za barkodiranje uzorka tkiva iz ciljanog uzorka vjerovatno će biti dovoljan mali komad kože, krljušt, noga ili antena (ovisno o veličini uzorka). Da bi se izbjegla kontaminacija, potrebno je sterilizirati korištene alate između uzoraka. Preporučuje se prikupljanje dva uzorka iz jednog izvora, jedan za arhiviranje, a jedan za proces barkodiranja. Očuvanje uzorka je ključno za prevazilaženje problema degradacije DNK. Uzorci u rasutom stanju Uzorak u rasutom stanju je vrsta uzorka iz okoliša koji sadrži nekoliko organizama iz taksonomske grupe koja se proučava. Razlika između uzoraka u rasutom stanju (u smislu koji se ovdje koristi) i drugih uzoraka iz okoliša je u tome što uzorak u rasutom stanju obično pruža veliku količinu DNK dobrog kvaliteta. Primjeri uzoraka u rasutom stanju uključuju uzorke vodenih makroinvertebrata prikupljene kick-net mrežom ili uzorke insekata prikupljene Malaiseovom klopkom. Filtrirani ili po veličini frakcionisani uzorci vode koji sadrže cijele organizme, poput jednoćelijskih eukariota također se ponekad definiraju kao uzorci u rasutom stanju. Takvi uzorci mogu se prikupiti istim tehnikama koje se koriste za dobijanje tradicionalnih uzoraka za identifikaciju na osnovu morfologije.
eDNK uzorci
Metoda DNK iz okoliša (eDNK) je neinvazivan pristup za detekciju i identifikaciju vrsta iz ćelijskih ostataka ili vanćelijske DNK prisutne u uzorcima iz okoliša (npr. voda ili tlo) putem barkodiranja ili metabarkodiranja. Pristup se zasniva na činjenici da svaki živi organizam ostavlja DNK u okolini, a ova DNK iz okoline može se detektovati čak i kod organizama koji su u vrlo maloj abundanciji. Stoga je za terensko uzorkovanje najvažniji dio korištenje materijala i alata bez DNK na svakom mjestu uzorkovanja ili uzorku kako bi se izbjegla kontaminacija, ako je vjerovatno da će DNK ciljnog organizma (organizama) biti prisutan u malim količinama. S druge strane, uzorak eDNK uvijek uključuje DNK cijelih ćelija, živih mikroorganizama, koji su često prisutni u velikim količinama. Stoga se uzorci mikroorganizama uzeti u prirodnom okruženju nazivaju i uzorcima eDNK, ali kontaminacija je u ovom kontekstu manje problematična zbog velike količine ciljnih organizama. Metode eDNK mogu se koristiti s većinom vrsta uzoraka, poput vode, tla, izmet]a, sadržaja želuca ili krvi.
Ekstrakcija, amplifikacija i sekvenciranje DNK
DNK barkodiranje zahtijeva da se DNK iz uzorka ekstrahuje. Postoji nekoliko različitih metoda ekstrakcija DNK, a faktori poput troškova, vremena, vrste uzorka i prinosa utiču na odabir optimalne metode.
Kada se DNK iz uzoraka organizma ili eDNK amplificira pomoću lančane polimerazne reakcije (PCR), na reakciju mogu negativno uticati molekule inhibitora sadržane u uzorku. Removal of these inhibitors is crucial to ensure that high quality DNA is available for subsequent analyzing. Amplifikacija ekstrahirane DNK je neophodan korak u DNK barkodiranju. Tipično, samo mali fragment ukupnog DNK materijala se sekvencira (obično 400–800 baznih parova) da bi se dobio DNK barkod i amplifikacija je shodno tome ograničena na fragment korištenjem para prajmera. Amplifikacija eDNK materijala obično je usmjerena na manje veličine fragmenata (<200 baznih parova) jer je eDNK vjerovatnije fragmentirana od DNK materijala iz drugih izvora. Međutim, neke studije tvrde da ne postoji veza između veličine amplikona i stope detekcije eDNK. thumb| HiSeq sekvenceri u SciLIfeLabu u Uppsali, Švedska. Fotografija je snimljena tokom ekskurzije na SLU kurs PNS0169 u martu 2019. godine. Kada je marker regije DNK barkoda amplifikovan, sljedeći korak je sekvenciranje marker regije korištenjem metoda sekvenciranja DNK. Dostupne su mnoge različite platforme za sekvenciranje, a tehnički razvoj se brzo odvija.
Selekcija markera thumb|600x600px| Shematski prikaz prajmera i ciljne regije, demonstriran na 16S rRNK genu u Pseudomonas. Kao prajmeri se obično biraju kratke konzervirane sekvence s niskom varijabilnosti, koje tako mogu amplificirati većinu ili sve vrste u odabranoj ciljnoj grupi. Prajmeri se koriste za amplifikaciju visoko varijabilne ciljne regije između dva prajmera, koja se zatim koristi za razlikovanje vrsta. Modificirano iz »Varijabilni broj kopija, intragenomske heterogenosti i lateralni transferi 16S rRNK gena u Pseudomonas« od Bodilis, Josselin; Nsigue-Meilo, Sandrine; Besaury, Ludovic; Quillet, Laurent, korišteno pod CC BY, dostupno na:https://www.researchgate.net/figure/Hypervariable-regions-within-the-16S-rRNA-gene-in-Pseudomonas-The-plotted-line-reflects_fig2_224832532. Markeri koji se koriste za DNK barkodiranje nazivaju se barkodovi. Da bi se uspješno okarakterizirale vrste na osnovu DNK barkodova, ključan je odabir informativnih DNK regija. Dobar DNK barkod treba imati nisku intraspecifičnu i visoku interspecifičnu varijabilnost i posjedovati konzervirana bočna mjesta za razvoj univerzalne Lančana polimerazne reakcije (PCR) prajmera za široku taksonomsku primjenu. Cilj je dizajnirati prajmere koji će detektovati i razlikovati većinu ili sve vrste u proučavanoj grupi organizama (visoka taksonomska rezolucija). Dužina sekvence barkoda treba biti dovoljno kratka da se može koristiti sa trenutnim izvorom uzorkovanja, metodama ekstrakcija DNK, amplifikacije lančane polimerazne reakcije i sekvenciranja DNK.
Bilo bi efikasnije koristiti jednu sekvencu gena za sve taksonomske grupe, od virusa do biljaka i životinja. Međutim, takva genska regija još nije pronađena, pa se za različite grupe organizama ili ovisno o pitanju istraživanja koriste različiti barkodovi. Za životinje, najčešće korišteni barkod je mitohondrijaki lokus citohrom C oksidaze I (COI). Drugi mitohondrijski geni, kao što su Cytb, 12S ili 16S također se koriste. Mitohondrijski geni poželjniji su od jedarnih gena zbog nedostatka introna, njihovog haploidnog načina nasljeđivanja inheritance i njihove ograničene rekombinacije. Štaviše, svaka ćelija ima različite mitohondrije (do nekoliko hiljada) i svaka od njih sadrži nekoliko kružnih molekula DNK. Stoga mitohondrije mogu ponuditi obilan izvor DNK čak i kada je uzorak tkiva ograničen.