thumb|320px| Pregled dvohibridnog testa, provjeravanja interakcija između dva proteina, ovdje zvana mamac i plijen. A – Gen faktora transkripcije Gal4 proizvodi protein sa dva domena (BD i AD), neophodan za transkripciju reporterskog gena (LacZ). B, C – Pripremanje se dva fuzijsa proteina: Gal4BD+mamac i Gal4AD+Prey (=plijen). Nijedan od njih obično nije dovoljan da sam započne transkripciju (reporterskog gena). D – Kada se proizvedu oba fuzijska proteina i, dio mamca prvog fuzijskog proteina stupi u interakciju sa plijenskim dijelom drugog i dolazi do transkripcije reporterskog gena. Dvohibridni pregled (prvobitno poznat kao dvohibridni sistem kvasca ili Y2H) je molekulskobiološka tehnika koja se koristi za otkrivanje interakcija protein-protein (PPI) i Interakcija protein–DNK testiranjem na fizičke interakcije (kao što je vezivanje) između dva proteina ili jednog proteina i molekula DNK,
Premisa testa je aktivacija nizvodno reporter gen(a) vezivanjem transkripcionog faktora na uzvodno aktivirajuću sekvencu (UAS). Za dvohibridni skrining, faktor transkripcije se dijeli na dva odvojena fragmenta, zvana domen za vezivanje DNK (DBD ili često skraćeno kao BD) i aktivirajući domen (AD). BD je domen odgovoran za DNK-vezivanje proteina koji se vezuje za za UAS, a AD domen odgovoran je za aktivaciju transkripcije. Y2H je stoga test komplementacije proteinskih fragmenata.
Osnovna premisa
Ključ dvohibridnog pregleda je da su, kod većine eukariotskih transkripcijskih faktora, domeni za aktiviranje i vezivanje modulne i mogu funkcionirati u blizini jedna drugoj, bez direktnog vezivanja. To znači da, iako je faktor transkripcije podijeljen na dva fragmenta, on i dalje može aktivirati transkripciju kada su dva fragmenta indirektno povezana.
Najčešći pristup skriningu je dvohibridni test kvasca. U ovom pristupu istraživač zna gdje se svaki plijen nalazi na korištenom mediju (agar ploče). Milioni potencijalnih interakcija u nekoliko organizama provjereni su u posljednjoj deceniji korištenjem sistema visokopropusnog skrininga (često pomoću robota) i preko hiljada interakcija je otkriveno i kategorizirano u bazama podataka kao što je BioGRID. Ovaj sistem često koristi genetički modifikovani soj kvasca u kojem nedostaje biosinteza određenih nutrijenata (obično aminokiselina ili nukleinskih kiselina). Kada se uzgaja na podlozi koja nema ove hranjive tvari, kvasac ne uspijeva preživjeti. Ovaj mutantni soj kvasca može se natjerati da inkorporira stranu DNK u obliku plazmida. U dvohibridnom skriningu kvasca, odvojeni plazmidi mamaca i plijena se istovremeno uvode u mutantni soj kvasca ili se koristi strategija uparivanja da se oba plazmida dođu u jednu ćeliju domaćina.
Drugi pristup visoke propusnosti je pristup pregleda biblioteke. U ovoj postavi, mamac i ćelije u kojima se nalazi plijen se uparuju nasumičnim redoslijedom. Nakon parenja i odabira preživjelih ćelija na selektivnom mediju, mogu se sekvencirati izolovani plazmidi, kako bi vidio koji plijen (sekvenca DNK) stupa u interakciju sa upotrijebljenim mamcem. Ovaj pristup ima nižu stopu ponovljivosti i ima tendenciju da daje veće količine lažnih pozitivnih rezultata u poređenju sa matričnim pristupom.
Plazmidi su konstruirani da sintetiziraju proteinski proizvod u kojem je fragment domena DNK (BD) fuzioniran na protein, dok je drugi plazmid konstruiran da proizvodi protein u kojem je fragment domena aktivacije (AD) fuzionisan na drugi protein. Protein spojen na BD može se nazvati proteinom mamaca i obično je poznati protein koji istraživač koristi za identifikaciju novih partnera za vezivanje. Protein spojen s AD može se nazvati proteinom plijena i može biti ili jedan poznati protein ili biblioteka poznatih ili nepoznatih proteina. U ovom kontekstu, biblioteka se može sastojati od kolekcije sekvenci koje kodiraju proteine i predstavljaju sve proteine eksprimirane u određenom organizmu ili tkivu, ili može biti generirana sintezom nasumičnih sekvenci DNK. Bez obzira na izvor, oni se zatim inkorporiraju u sekvencu plazmida koja kodira proteine, koji se zatim transficira u ćelije odabrane za primjenu skrininga. Ova tehnika, kada se koristi biblioteka, pretpostavlja da svaka ćelija nije transficirana sa ne više od jednog plazmida i da, stoga, svaka ćelija na kraju ne eksprimira više od jednog člana iz biblioteke proteina.
Ako su proteini mamaca i plijena u interakciji (tj. vežu se), tada su AD i BD faktori transkripcije indirektno povezani, dovodeći AD u blizinu početnog mjesta transkripcije i može doći do transkripcije reporterskih gena. Ako dva proteina nisu u interakciji, nema transkripcije reporterskog gena. Na ovaj način, uspješna interakcija između prerađenog proteina povezana je s promjenom ćelijskog fenotipa.
Reference
Vanjski linkovi Detail on sister technique two-hybrid system Science Creative Quarterly's overview of the yeast two hybrid system Gateway-Compatible Yeast One-Hybrid Screens Video animation of the Yeast Two-Hybrid System
Yeast Two-Hybrid BioGrid Database with protein-protein interactions
Kategorija:Citologija Kategorija:Molekularna biologija Kategorija:Testovi interakcije protein-protein Kategorija:Sistemska biologija