U biohemiji, flavin adenin dinukleotid (FAD) je redoks-aktivni koenzim povezan s raznim proteinima, koji je uključen u nekoliko enzimskih reakcija u metabolizmu. Flavoprotein je protein koji sadrži flavinsku grupu, koja može biti u obliku FAD ili flavin-mononukleotida (FMN). Poznati su mnogi flavoproteini: komponente kompleksa sukcinat dehidrogenaze, α-ketoglutarat dehidrogenaze i komponenta kompleksa piruvat dehidrogenaze.
FAD može postojati u četiri redoks stanja, a to su flavin-N(5)-oksid, kinon, semikinon i hidrokinon. FAD se pretvara između ovih stanja prihvatanjem ili doniranjem elektrona. FAD, u svom potpuno oksidiranom obliku, ili kinonskom obliku, prihvata dva elektrona i dva protona da postane FADH2 (hidrokinonski oblik). Semikinon (FADH2) može nastati ili redukcijom FAD-a ili oksidacijom FADH2 prihvatanjem ili doniranjem jednog elektrona, odnosno jednog protona. Neki proteini, međutim, stvaraju i održavaju superoksidirani oblik flavin-kofaktora, flavin-N(5)-oksida.
Historija Flavoproteini su prvi put otkriveni 1879., odvajanjem komponenti kravljeg mlijeka. U početku su ih zvali laktohrom zbog svog mliječnog porijekla i žutog pigmenta. Znanstvenoj zajednici trebalo je 50 godina da postigne značajan napredak u identificiranju molekula odgovornih za žuti pigment. 1930-ih godina pokrenuto je polje istraživanja koenzima, objavljivanjem mnogih flavina i nikotinamidnih derivatnih struktura i njihovih obaveznih uloga u redoks katalizi. Njemački znanstvenici Otto Warburg i Walter Christian otkrili su 1932. žuti protein iz kvasca koji je potreban za ćelijsko disanje. Njihov kolega Hugo Theorell odvojio je ovaj žuti enzim kod apoenzima i žutog pigmenta, te je pokazalo da ni enzim ni pigment nisu sposobni sami oksidirati NADH, ali bi njihovo zajedničko miješanje obnovilo aktivnost. Theorell je potvrdio da je pigment riboflavin fosfatni ester, flavin-mononukleotid (FMN) 1937., što je bio prvi izravni dokaz za enzimske kofaktore. Warburg i Christian su zatim otkrili da je FAD kofaktor D-aminokiselinske oksidaze u sličnim eksperimentima, 1938. Warburgov rad na povezivanju nikotinamida sa hidridnim transferima i otkrićem flavina otvorio je put mnogim naučnicima 40-ih i 50-ih godina da otkriju obilne količine redoksne biohemije i povežu ih zajedno na puteve kao što su ciklus limunske kiseline i sinteza ATP.
Svojstva
Flavin adenin-dinukleotid sastoji se od dva dijela: adenin-nukleotid (adenozin-monofosfat) i flavin-mononukleotid (FMN) premoštenih zajedno preko fosfatne grupe. Adenin je vezan za cikličku ribozu na 1' ugljiku, dok je fosfat vezan za ribozu na 5' ugljiku da bi formirao adenin-nukledotid . Riboflavin nastaje vezom ugljik-dušik (C-N) između izoaloksazina i ribitola. Fosfatna grupa se zatim vezuje za terminalni ugljik riboze, formirajući FMN. Budući da se veza između izoaloksazina i ribitola ne smatra glikozidnom vezom, flavin-mononukleotid nije istinski nukleotid. Ovo čini naziv dinukleotida pogrešnim; međutim, flavin-mononukleotidna grupa je još uvijek vrlo bliska nukleotidu po svojoj strukturi i hemijskim svojstvima. 422px|thumb|left|Reakcija FAD-a u oblik FADH2 thumb|Približan apsorpcijski spektar za FAD
FAD se može reducirati na FADH2 dodavanjem 2 H+ i 2 e–. FADH2 također može biti oksidiran, gubitkom 1 H+ i 1 e– da bi se formirao FADH. FAD obrazac može se ponovo kreirati kroz dalji gubitak 1 H+ i 1 e–. Do stvaranja FAD-a može doći i redukcijom i dehidracijom flavin-N(5)-oksida. Na osnovu oksidacijskog stanja, flavini poprimaju određene boje kada su u vodenom rastvoru. Flavin-N(5)-oksid (superoksidiran) je žuto-narandžast, FAD (potpuno oksidiran) je žut, FADH (polureduciran) je ili plav ili crven na osnovu pH, a potpuno redukovana forma je bezbojna. Promjena oblika može imati veliki uticaj na ostala hemijska svojstva. Naprimjer, FAD, potpuno oksidirani oblik je podložan nukleofilnom napadu, potpuno redukovani oblik, FADH2 ima visoku polarizabilnost, dok je poluredukovani oblik nestabilan u vodenom rastvoru. FAD je sistem aromatskih prstenova, dok FADH2 nije. To znači da FADH2 ima znatno više energije, bez stabilizacije kroz rezonanciju koju aromatska struktura pruža. FADH2 je molekula koji nosi energiju, jer nakon oksidacije ponovo dobija aromatičnost i oslobađa energiju koju predstavlja ova stabilizacija.
Spektroskopska svojstva FAD-a i njegovih varijanti omogućavaju praćenje reakcije upotrebom UV-VIS apsorpcija i fluorescencentna spektroskopija. Svaki oblik FAD-a ima različite spektre apsorpcije, što olakšava posmatranje promjena u oksidacijskom stanju. Glavni lokalni maksimum apsorpcije za FAD je uočen na 450 nm, sa koeficijentom ekstinkcije od 11.300 M−1cm−1. Flavini općenito imaju fluorescentnu aktivnost kada su nevezani (proteini vezani za derivate nukleinske kiseline flavina nazivaju se flavoproteini). Ovo svojstvo može se koristiti kada se ispituje vezivanje proteina, posmatrajući gubitak fluorescentne aktivnosti kada se stavi u vezano stanje.
Hemijska stanja
U biološkim sistemima, FAD djeluje kao akceptor H+ i e– u svom potpuno oksidiranom obliku, akceptor ili donor u FADH obliku i donor u reduciranom obliku. FADH2 obrazac. Dijagram u nastavku sumira potencijalne promjene koje može proći.
Zajedno sa gore navedenim, mogu se formirati i konzumirati i drugi reaktivni oblici FAD-a. Ove reakcije uključuju prijenos elektrona i stvaranje/razbijanje hemijskih veza. Kroz reakcione mehanizme, FAD je u stanju da doprinese hemijskim aktivnostima unutar bioloških sistema. Sljedeće slike prikazuju opće oblike nekih radnji u koje FAD može biti uključen.
Mehanizmi 1 i 2 predstavljaju hidridnu dobit, u kojoj molekula dobija ono što iznosi jedan hidridni ion. Mehanizmi 3 i 4 formiranje radikala i hibridni gubitak. Radikalne vrste sadrže nesparene atome elektrona i veoma su hemijski aktivne. Gubitak hidrida je inverzni proces povećanja hidrida koji smo ranije vidjeli. Poslednja dva mehanizma pokazuju nukleofilnu adiciju i reakciju koja koristi ugljični radikal. 400px|thumb|left| Mehanizam 1: Transfer hidrida dešava se dodavanjem H+ i 2 e– 400px|thumb|right| Mehanizam 2: Transfer hidrida apstrakcijom hidrida iz NADH 400px|left|thumb| Mehanizam 3: Formiranje radikala apstrakcijom elektrona 400px|right|thumb| Mehanizam 4: Gubitak hibrida na R grupu sa nedostatkom elektrona 400px|left|thumb| Mehanizam 5: Upotreba nukleofilnog dodatka za prekid R1-R2 veze 550 px|right|thumb| Mehanizam 6: Ugljični radikal reaguje sa O2 i kiselinom da formira H2O2
Biosinteza
FAD ima glavnu ulogu kao enzimski kofaktor zajedno sa flavin-mononukleotidom, još jednom molekulom koja potiče od riboflavina. Bakterije, gljive i biljke mogu proizvoditi riboflavin, ali drugi eukarioti, kao što su ljudi, izgubili su sposobnost da ga naprave. Stoga, ljudi moraju dobiti riboflavin, također poznat kao vitamin B2, iz izvora ishrane. Riboflavin se generalno unosi u tanko crijevo, a zatim se transportuje do ćelija putem proteina nosača. Riboflavin-kinaza (EC 2.7.1.26) dodaje fosfatnu grupu riboflavinu da bi proizveo flavin-mononukleotid, a zatim FAD-sintetaza vezuje adenin nukleotid; oba koraka zahtijevaju ATP. Bakterije općenito imaju jedan bifunkcionalni enzim, ali Archaea i eukarioti obično koriste dva različita enzima. Dosadašnja istraživanja pokazuju da različite izoforme postoje u citosolu i mitohondrijama. Čini se da je FAD sintetizirano na obje lokacije i potencijalno transportirano gdje je potrebno. 250px
Funkcija Flavoproteini koriste jedinstvenu i raznovrsnu strukturu flavinskih dijelova da kataliziraju teške redoks reakcije. Budući da flavini imaju više redoks stanja, mogu učestvovati u procesima koji uključuju prijenos jednog ili dva elektrona, atoma vodika ili hidronijevog iona. N5 i C4a potpuno oksidovanog flavinskog prstena su takođe podložni nukleofilnom napadu. Ova široka raznolikost ionizacije i modifikacije flavinskog dijela može se pripisati sistemu izoaloksazinskih prstenova i sposobnosti flavoproteina da drastično remete kinetičke parametre flavina nakon vezivanja, uključujući flavin adenin-dinukleotid (FAD).
Broj gena za kodiranje sinteze flavina zavisnih od proteina u genomu (flavoproteom) zavisi od vrste i može se kretati od 0,1% – 3,5%, pri čemu ljudi imaju 90 gena kodiranja flavoproteina. FAD je složeniji i bogatiji oblik flavina i navodi se da se vezuje za 75% ukupnog flavoproteoma i 84% flavoproteina kodiranih kod ljudi. Prijavljene su ćelijske koncentracije slobodnih ili nekovalentno vezanih flavina u različitim kultiviranim ćelijskim linijama sisara za FAD (2,2-17,0 amol/ćeliju) i FMN (0,46-3,4 amol/ćeliju).).
FAD ima pozitivniji redukcioni potencijal od NAD+ i veoma je jak oksidans. Ćelija to koristi u mnogim energetski teškim reakcijama oksidacije kao što je dehidrogenacija C-C veze na alkenu. FAD-ovisni proteini funkcionišu u velikom broju metaboličkih puteva uključujući transport elektrona, popravku DNK, biosintezu nukleotida, beta-oksidaciju masnih kiselina, katabolizam aminokiselina, kao i sintezu drugih kofaktora kao što su CoA, CoQ i hem grupe. Jedna dobro poznata reakcija je dio ciklusa limunske kiseline (također poznat kao TCA ili Krebsov ciklus); sukcinat-dehidrogenaza (kompleks II u lancu transporta elektrona) zahtijeva kovalentno vezan FAD da katalizira oksidaciju sukcinata u fumarat, spajanjem sa redukcijom ubikinona do ubikinola. Visokoenergetski elektroni iz ove oksidacije se trenutno pohranjuju, redukcijom FAD u FADH2. FADH2 se zatim vraća u FAD, šaljući svoja dva elektrona visoke energije kroz lanac transporta elektrona; energija u FADH2 je dovoljna da proizvede 1,5 ekvivalenata ATP oksidativnom fosforilacijom. Neki redoks flavoproteini se nekovalentno vezuju za FAD poput acetil-CoA-dehidrogenaze koji su uključeni u beta-oksidaciju masnih kiselina i katabolizam aminokiselina poput leucina (izovaleril-CoA dehidrogenaza), izoleucin, (acil-CoA dehidrogenaza kratkog/razgranatog lanca), valin (izobutiril-CoA dehidrogenaza) i lizin (glutaril- CoA dehidrogenaza). Dodatni primjeri enzima zavisnih od FAD-a koji reguliraju metabolizam su glicerol-3-fosfat dehidrogenaza (sinteza triglicerida) i ksantin-oksidaza uključeni u katabolizam purinskih nukleotida Nekatalitske funkcije koje FAD može imati u flavoproteinima uključuju strukturne uloge ili uključene u svjetlo osjetljivo na plavo fotoreceptore koji reguliraju biološke satove i razvoj, stvaranje svjetlosti u bioluminiscentnim bakterijama.
Flavoproteini
Flavoproteini imaju ili FMN ili FAD molekulu kao prostetsku grupu, koja može biti čvrsto vezana ili kovalentno povezana. Samo oko 5–10% flavoproteina ima kovalentno povezan FAD, ali ovi enzimi imaju jaču redoksnu moć. U nekim slučajevima, FAD može pružiti strukturnu podršku za aktivna mjesta ili osigurati stabilizaciju intermedijara tokom kataliza. Na osnovu dostupnih strukturnih podataka, poznata mjesta vezana za FAD mogu se podijeliti u više od 200 tipova.
U ljudskom genomu, kodirano je 90 flavoproteina; oko 84% zahtijeva FAD, a oko 16% zahtijeva FMN, dok 5 proteina zahtijeva da oba budu prisutna. Flavoproteini se uglavnom nalaze u mitohondrijama zbog njihove redoks moći. Od svih flavoproteina, 90% vrši redoksne reakcije, a ostalih 10% su transferaze, lijaze, izomeraze, ligaze.
Oksidacija ugljenik-heteroatom veza
Ugljik–dušik