thumb|upright=1.5| U metagenomici, genetički materijali (DNK, C) se ekstrahuju direktno iz uzoraka uzetih iz okoline (npr. tla, morske vode, ljudska crijeva, A) nakon filtriranja (B), i sekvenciranja (E) nakon umnožavanja kloniranjem ('D) u pristupu koji se zove nasumično sekvenciranje. Ove kratke sekvence se zatim mogu ponovo sastaviti koristeći metoda sastavljanja (F) da bi se zaključili pojedinačni genomi ili dijelovi genoma koji čine originalni uzorak životne sredine. Ove informacije se zatim mogu koristiti za proučavanje raznolikosti vrsta i funkcionalnog potencijala mikrobne zajednice životne sredine.
Metagenomika je proučavanje genetičkog materijala dobijenog direktno iz okruženja ili kliničkih uzoraka, metodom zvanom sekvenciranje. Široko polje se također može nazvati genomika okoline, ekogenomika, genomika zajednice ili mikrobiomika.
Dok se tradicionalna mikrobiologija i mikrobno sekvenciranje genoma i genomika oslanjaju na kultivirane klonske kulture, rano sekvenciranje gena u okolini kloniralo je specifične gene (često 16S rRNK) za proizvodnju profila raznolikosti u prirodnom uzorku. Takav rad je otkrio da je velika većina mikrobne bioraznolikosti propuštena metodama zasnovanim na uzgoju.
Zbog svoje sposobnosti da otkrije prethodno skrivenu raznolikost mikroskopskog života, metagenomika nudi moćno sočivo za sagledavanje mikrobnog svijeta, koje ima potencijal da revolucionira razumijevanjem cijelog živog svijeta. Kako cijena sekvenciranja DNK nastavlja da opada, metagenomika sada omogućava da se mikrobna ekologija istražuje u mnogo većoj skali i detaljima nego prije. Nedavne studije koriste ili "nasumićno sekvenciranje" ili PCR usmjereno sekvenciranje kako bi se dobili uglavnom nepristrasni uzorci svih gena od svih članova uzorkovanih zajednica.
Etimologija Termin "metagenomika" prvi su upotrijebili Jo Handelsman, Robert M. Goodman, Michelle R. Rondon, Jon Clardy i Sean F. Brady, a prvi put se pojavio u publikaciji 1998. Termin metagenom se odnosio na ideju da se kolekcija gena sekvenciranih iz okoline može analizirati na način analogan proučavanju jednog genoma. Godine 2005., Kevin Chen i Lior Pachter (istraživači na Univerzitetu Kalifornije, Berkeley) definisali su metagenomiku kao "primenu moderne tehnike genomike bez potrebe za izolacijom i laboratorijskim uzgojem pojedinačnih vrsta".< ref name="Chen2005"/>
Historija
Konvencijsko sekvenciranje počinje kulturom identičnih ćelija kao izvora DNK. Međutim, rane metagenomske studije otkrile su da vjerovatno postoje velike grupe mikroorganizama u mnogim sredinama koje se ne mogu kultivisati i stoga ne mogu sekvencirati. Ove rane studije fokusirale su se na sekvence 16S ribosomske RNK (rRNK) koje su relativno kratke, često konzervirane unutar vrsta, i općenito različite među vrstama. Pronađene su mnoge sekvence 16S rRNK koje ne pripadaju nijednoj poznatoj kultivisanoj vrsti, što ukazuje da postoje brojni neizolovani organizmi. Ova istraživanja gena ribosomske RNK uzetih direktno iz okoline otkrila su da metode zasnovane na kultivaciji pronalaze manje od 1% bakterijskih i Archaeal vrsta u uzorku. Veliki dio interesovanja za metagenomiku potiče od ovih otkrića koja su pokazala da je velika većina mikroorganizama ranije prošla nezapaženo. Ranih 1980-ih molekulska istraživanja na terenu su vodili Norman R. Pace i kolege, koji su koristili PCR za istraživanje raznolikosti sekvenci ribosomske RNK. Uvidi stečeni iz ovih revolucionarnih studija naveli su Pacea da predloži ideju kloniranja DNK direktno iz uzoraka okoliša još 1985. Ovo je dovelo do prvog izvještaja o izolaciji i kloniranja masovne DNK iz uzorka okoliša, koji su objavili Pace i kolege 1991. dok je Pace bio na Odsjeku za biologiju u Univerziteta Indijana. Značajni napori su osigurali da ovo nisu PCR lažno pozitivni i podržali postojanje složene zajednice neistraženih vrsta. Iako je ova metodologija bila ograničena na istraživanje visoko konzerviranih, gena koji ne kodiraju proteine, ona je podržala rana zapažanja zasnovana na mikrobnoj morfologiji da je raznolikost daleko složenija nego što je to bilo poznato metodama uzgoja. Ubrzo nakon toga, 1995. godine, Healy je izvijestio o metagenomskoj izolaciji funkcionalnih gena iz "zooliblioteka" konstruiranih od kompleksne kulture ekoloških organizama uzgojenih u laboratoriji na osušenim travama. Nakon odlaska Laboratorija Pace, Edward DeLong nastavio je na terenu i objavio rad koji je u velikoj mjeri postavio temelje za filogenije životne sredine, zasnovane na signaturnim sekvencama 16S, počevši od njegove grupe izgradnjom biblioteka iz morskih uzoraka .
Godine 2002. Mya Breitbart, Forest Rohwer i kolege su koristili nasumično sekvenciranje (vidi dolje) kako bi pokazali da 200 litara morske vode sadrži preko 5000 različitih virusa. Naknadne studije su pokazale da postoji više od hiljadu vrsta virusa u ljudskoj stolici i možda milion različitih virusa po kilogramu morskog sedimenta, uključujući mnoge bakteriofage. U suštini svi virusi u ovim studijama bili su nove vrste. Godine 2004, Gene Tyson, Jill Banfield i kolege sa Univerzitet Kalifornije, Berkeley i Joint Genome Institute su sekvencionirali DNK ekstrahiranu iz acid mine drainage sistema. Ovaj napor je rezultirao kompletnim, ili gotovo potpunim, genomima za šačicu bakterija i archaea koji su se ranije odupirali pokušajima njihovog uzgoja.
Počevši od 2003. godine, Craig Venter, vođa privatno finansirane paralele Projekta ljudskog genoma, predvodi Globalnu ekspediciju za uzorkovanje okeana (GOS), obilazeći svijet i prikupljajući metagenomske uzorke širom svijeta putovanje. Svi ovi uzorci su sekvencionirani pomoću nasumičnog sekvenciranja, u nadi da će novi genomi (a samim tim i novi organizmi) biti identificirani. Pilot projekat, sproveden u Sargaškom moru, pronašao je DNK od skoro 2000 različitih vrsta, uključujući 148 tipova bakterija koje nikada ranije nisu viđene. Venter je temeljito istražio Zapadnu obalu Sjedinjenih Država, i završio dvogodišnju ekspediciju da istraži Baltik, Mediteran i Crno more. Analiza metagenomskih podataka prikupljenih tokom ovog putovanja otkrila je dvije grupe organizama, jednu sastavljenu od taksona prilagođenih ekološkim uvjetima 'gozba ili glad', a drugu sastavljenu od relativno manjeg broja, ali obilnije i šire rasprostranjenih taksona prvenstveno sastavljenih od planktona.
Godine 2005. Stephan C. Schuster i kolege sa Penn State University objavili su prve sekvence uzorka okoline generirane pomoću visokopropusnog sekvenciranja, u ovom slučaju masovno paralelnog pirosekvenciranja koje je razvio 454 Life Sciences. Još jedan rani rad u ovoj oblasti pojavio se 2006. Robert Edwards, Forest Rohwer, i kolege sa San Diego State Univerziteta.
Sekvenciranje thumb|Dijagram toka tipskog projekta metagenoma
Oporavak DNK sekvenci dužih od nekoliko hiljada baznih parovas iz okoline uzoraka bio je veoma težak sve dok nedavni napredak u molekularno biološkim tehnikama nije omogućio konstrukciju biblioteke u bakterijski umjetni hromozom (BAC), što je omogućilo bolje vektore za molekularno kloniranje.
Nasumična metagenomika Napredak u bioinformatici, poboljšanja amplifikacije DNK i širenje računarske snage uveliko su pomogli analizi sekvenci DNK dobijenih iz uzoraka okoline, omogućavajući prilagođavanje nasumičnog sekvenciranja metagenomskim uzorcima (poznatim i kao cjeloviti metagenomska sačmarica ili WMGS sekvenciranje). Pristup, koji se koristi za sekvenciranje mnogih kultiviranih mikroorganizama i ljudski genom, nasumično siječe DNK, sekvencira mnogo kratkih sekvenci i rekonstruiše ih u konsenzusnu sekvencu. Nasumično sekvenciranje otkriva gene prisutne u uzorcima okoliša. Historijski gledano, biblioteke klonova su korištene da bi se olakšalo ovo sekvenciranje. Međutim, s napretkom u tehnologijama sekvenciranja visoke propusnosti, korak kloniranja više nije neophodan i veći prinosi podataka sekvenciranja mogu se dobiti bez ovog napornog koraka uskog grla. Ova metagenomika pruža informacije o tome koji su organizmi prisutni i koji su metabolički procesi mogući u zajednici. Budući da je prikupljanje DNK iz okoline uglavnom nekontrolisano, najzastupljeniji organizmi u uzorku životne sredine su najzastupljeniji u rezultujućim podacima sekvence. Da bi se postigla visoka pokrivenost koja je potrebna za potpuno rješavanje genoma nedovoljno zastupljenih članova zajednice, potrebni su veliki uzorci, često pretjerano. S druge strane, nasumična priroda sekvenciranja osigurava da će mnogi od ovih organizama, koji bi inače ostali nezapaženi koristeći tradicijske tehnike uzgoja, biti predstavljeni barem nekim malim segmentima sekvence.
Visokopropusno sekvenciranje Prednost sekvenciranja visoke propusnosti je ta što ova tehnika ne zahtijeva kloniranje DNK prije sekvenciranja, uklanjajući jednu od glavnih predrasuda i uskih grla u uzorkovanju okoliša. Prve metagenomske studije sprovedene korišćenjem visokopropunsnog sekvenciranja koristile su masovno paralelno sa 454 pirosekvenciranjem. Tri druge tehnologije koji se uobičajeno primenjuju na uzorkovanje životne sredine su Ionske Torrentove personalne genomske mašine, Illumina MiSeq ili HiSeq i Applied Biosystems SOLiD sistem. Ove tehnike sekvenciranja DNK stvaraju kraće fragmente od Sangerovskog sekvenciranja; Ion Torrent PGM sistem i 454 pirosekvenci obično daju ~400 bp čitanja, Illumina MiSeq proizvodi 400-700bp čitanja (u zavisnosti od toga da li se koriste uparene krajnje opcije), a SOLiD proizvodi 25-75 bp čitanja. Istorijski gledano, ove dužine čitanja su bile znatno kraće od tipične dužine čitanja Sanger sekvence od ~750 bp, međutim Illumina tehnologija se brzo približava ovom standardu. Međutim, ovo ograničenje je nadoknađeno mnogo većim brojem čitanja sekvence. U 2009. metagenomi s pirosekvenciranjem generiraju 200–500 megabaza, a Illumina platforme generiraju oko 20–50 gigabaza, ali su se ti rezultati posljednjih godina povećali za redove veličine.
Pristup u nastajanju kombinuje nasumično sekvenciranje i hvatanje konformacije hromosoma (Hi-C), koji mjeri blizinu bilo koje dvije DNK sekvence unutar iste ćelije, kako bi se usmjerio sklop mikrobnog genoma. Tehnologije za sekvenciranje dugog čitanja, uključujući PacBio RSII i PacBio Sequel od Pacific Biosciences, i Nanopore MinION, GridION, PromethION od Oxford Nanopore Technologies, je još jedan izbor za dobijanje dugih čitanja sekvenci sačmarica koja bi trebala olakšati proces sastavljanja.
Bioinformatika
thumb|450px| Shematski prikaz glavnih koraka potrebnih za analizu podataka izvedenih sekvenciranjem cijelog nasumičnog metagenoma. Softver koji se odnosi na svaki korak prikazan je kurzivom. Podaci dobijeni metagenomskim eksperimentima su ogromni i inherentno bogati, sadrže fragmentirane podatke koji predstavljaju čak 10.000 vrsta.[ Sekvenciranje metagenoma kravljeg rumena generiralo je 279 gigabaza, ili 279 milijardi baznih parova podataka o sekvenci nukleotida, dok je katalog gena mikrobioma ljudskog crijeva identificirao 3,3 miliona gena sastavljenih iz 567,7 gigabaza podataka o sekvenci. Prikupljanje, kuriranje i izdvajanje korisnih bioloških informacija iz skupova podataka ove veličine predstavljaju značajan računski izazov za istraživače.
Prefiltriranje sekvence Prvi korak analize metagenomskih podataka zahtijeva izvršenje određenih koraka prethodnog filtriranja, uključujući uklanjanje suvišnih, nekvalitetnih sekvenci i sekvenci vjerovatnog eukariotskog porijekla (posebno u metagenomima ljudskog porijekla). Dostupni metodi za uklanjanje kontaminirajućih eukariotskih genomskih DNK sekvenci uključuju Eu-Detect i DeConseq.
Sklapanje