Insulinom regulirana aminopeptidaza (IRAP) je protein koji je kod ljudi kodiran genom LNPEP (leucil i cistinil aminopeptidaza), sa hromosoma 5, sekvenca 5q15. IRAP je transmembranski protein tipa II koji pripada potporodici oksitocinaza, M1 aminopeptidaza, zajedno s ERAP1 i ERAP2. Također je poznat kao oksitocinaza, leucil i cistinil aminopeptidaza, placentalna leucin-aminopeptidaza (P-LAP), cistinil-aminopeptidaza (CAP) i vazopresinaza. IRAP eksprimira se u različitim tipovima ćelija, uglavnom smještenim u specijaliziranim reguliranim endosomima, koji se mogu regrutirati na površinu ćelije nakon aktivacije receptora specifičnog za tip ćelije.
Biologija / Funkcije Funkcije IRAP-a zavise od tipa ćelije i vanćelijskog okruženja. Naprimjer, u adipocitima i mišićnim ćelijama, IRAP je glavna komponenta Glut4vezikula za skladištenje (GSV) i reguliše promet GSV-a kao odgovor na signalizaciju insulinskog receptora. Promjena regrutacije IRAP-a na površini ćelije, kao što je uočeno kod dijabetesa tipa 2, oštećuje unos glukoze, blokiranjem prometa transportera glukoze tipa 4 (Glut4) na ćelijskoj membrani. Ovaj dokaz je u osnovi centralne funkcije aminopeptidaze u ovoj bolesti. IRAP cijepa nekoliko hormona, vazoaktivnih peptida i neuropeptida kao što su oksitocin, somatostatin, holecistokinin, angiotenzin III (Ang), Lys-bradikinin, argininski vazopresin, Met– i Leu-enkefalin, neurokinin A i dinorfin A. Većina njih ima primarne funkcije u razvoju nervnih poremećaja, uključujući shizofreniju i poremećaje pamćenja.[ Nadalje, promjena u nivoima neuropeptida, zbog deregulacije IRAP-a, čini se da je jedan od mehanizama koji utiču na procese učenja i kognitivnih procesa, što ističe fundamentalnu funkciju IRAP-a i kod poremećaja pamćenja.
U mozgu, IRAP je glavni receptor Ang IV, esencijalne komponente renin-angiotenzinskog sistema za koji je dokazano da ima neuroprotektivni učinak. Ovi dokazi su podstakli istraživanje razvoja analoga sa visokom IRAP selektivnošću, koji pokazuju potencijal u poboljšanju pamćenja, vaskularnoj regulaciji i antikonvulzivnim/antiepileptogenim efektima. Ovi analozi su proučavani za neurodegenerativne bolesti, pokazujući poboljšanu stabilnost i prodiranje u mozak, snažan afinitet vezivanja za ciljane receptore i pozitivne efekte na kognitivne funkcije i neuroprotekciju kod životinjskih modela. Također je utvrđeno da inhibitori IRAP-a djeluju protiv vazokonstrikcije, izazvane acetilholinom in vivo, što naglašava ulogu IRAP-a u modulaciji vaskularne funkcije. Delecija IRAP-a smanjuje osjetljivost na napade izazvane pentilentetrazolom kod miševa, što ukazuje na njegov potencijal kao terapijske mete za epilepsiju. IRAP ima važnu ulogu u regulaciji imunskog sistema. Slično ERAP1 i ERAP2, IRAP je u stanju da skrati N-terminalni dio antigenih peptida, smanjujući njihovu dužinu na 8–10 aminokiselina, što je optimalna dužina za vezivanje za MHC klasu I. Za razliku od ERAP1 i ERAP2, nema dokaza o skraćivanju antigenih peptida, posredovanom IRAP-om u endoplazmatskom retikulumu za prezentaciju MHC-I direktnim putem. S druge strane, IRAP ima primarnu funkciju u unakrsnoj prezentaciji. Ovdje aminopeptidaza skraćuje unakrsno prezentirane peptide u specifičnom endosomskom odjeljku, opisanom u dendritičnim ćelijama, prije njihovog učitavanja na molekule MHC klase I povezane s IRAP-om. IRAP stabilizira određeni tip reguliranih ranih endosoma u kojima se nalazi. Stabilnost ovih endosoma ključna je za put unakrsne prezentacije u dendritskim ćelijama i regulira nekoliko endosomanih signalnih puteva (TCR, TLR9, TNFα, IL-6) u drugim tipovima imunskih ćelija. U T-ćelijama, IRAP regulira promet TCD3ζ lanaca, koji se regrutuju u IRAP intraćelijske vezikule, kao i endosomnu signalizaciju putem TCR-kompleksa. Smanjenje IRAP-a povećava nivoe TCR-a na površini ćelije, što, međutim, pokazuje defektnu signalizaciju. Druge studije pokazale su da IRAP reguliše aktivaciju Toll-likog receptora 9 (TLR9) odgađanjem sazrijevanja endosoma koji sadrže TLR9 u lizosome i, kao posljedicu, ograničavanjem cijepanja i aktivacije TLR9. Konačno, IRAP ima važnu ulogu u lučenju proupalnih citokina TNFα i IL-6 od strane mastocita. U odsustvu IRAP-a, transport vezikula koje sadrže TNFα i IL-6 od Golgijevog aparata do plazmamembrana je otežan.
Genetika / Klinički značaj
Lokacija gena IRAP je kodiran genom LNPEP (leucil i cistinil aminopeptidaza), koji se nalazi na hromosomu 5q15. Ovaj gen je dug ~75 kb i sastoji se od 18 egzonna i 17 introna. Prema Ensembl.org, LNPEP ima pet transkripata, ali samo jednu glavnu eksprimiranu izoformu (NM_005575.3).
SNP-ovi Među različitim genetičkim varijantama koje su do sada identificirane, nekoliko varijante jednog nukleotida povezano je s bolestima. Velika većina jednonukleotidnih varijanti u LNPEP su intronske; dio su proširenog haplotipa koji funkcionira kao transkripcijski pojačivač susjednog gena ERAP2, ali ne regulira ekspresiju LNPEP. U stvari, u usporedbi s članovima porodice M1-aminopeptidaza ERAP1 i ERAP2, LNPEP pokazuje nisku toleranciju na genetičke varijacije koje skraćuju proteine i sadrži malo varijanti s gubitkom funkcije u svom genu.
Povezanost s bolešću LNPEP ima pet uobičajenih (>1% kod GnomAD) missens varijanti od kojih je najčešća rs2303138, koja dovodi do supstitucije aminokiselina (Ala763Thr), povezana s rizikom od psorijaze i ankilozirajućeg spondilitisa. Precizna uloga IRAP-a u ovim stanjima ostaje nepoznata, ali s obzirom na njegovu uključenost u aktivaciju adaptivnog i urođenog imunskog odgovora, renin-angiotenzinskog sistema (RAS) i metabolizma glukoze, ove genetičke varijante mogu imati plejotropne uticaje na imunski, cirkulatorni i metabolički sistem. Two other common missense variants rs41276279 (p. Val373Ile) and rs11746232 (p. Ile963Val) moderately correlate with LNPEP gene expression levels (reference to gtexportal.org) but have not been linked to disease so far.
Struktura / Mehanizam
Struktura Ljudski IRAP gen kodira transmembranski protein tipa II koji se sastoji od tri različita domena: N-terminalnog citoplazmatskog domena koji sadrži 109 aminokiselina, transmembranskog od 23 aminokiseline i intralumenskog (ili vamćelijskog) domena sastavljenog od 893 aminokiseline. C-terminalni intraendosomni domen sadrži motiv vezivanja Zn poznat kao HEXXH(X)18E, kao i motiv egzopeptidaze GAMEN. Ova dva motiva su također prisutna u ERAP1 i ERAP2 i zajednički su svim članovima M1 porodice aminopeptidaza. C-terminalni domen je kristaliziran kao dimer, pri čemu svaki monomer se sastoji od četiri kontinuirana domena i formira zatvorenu šuplju strukturu s aktivnim mjestom u svom centru. Domen I (ostaci 171–365) formira opsežni β-sendvič sa sedmolančanim β-sedlom, okruženim s obje strane trolančanim i četverolančanim β-listovima. Domen II (ostaci 366–615) sadrži katalitsko mjesto sa Zn ionom u svom centru. Katalitski Zn-ion, koordiniran je His464, His468 i Glu487 motiva za vezivanje cinka u HEXXH(X)18-E. Domen III (ostaci 616–704) usvaja β-sendvič nabor koji se sastoji od trostrukih i četverolančanih β-listova i formira most između domena II i IV. Domen IV (ostaci 705–1025) sastoji se od α-heliksa i sastavlja se u obliku "zdjele". Aktivno mjesto IRAP-a prekriveno je domenom IV, formirajući veliku, uglavnom zatvorenu šupljinu uz Zn ion.
Aminokiselinska sekvenca
1020304050 MEPFTNDRLQLPRNMIENSMFEEEPDVVDLAKEPCLHPLEPDEVEYEPRG SRLLVRGLGEHEMEEDEEDYESSAKLLGMSFMNRSSGLRNSATGYRQSPD GACSVPSARTMVVCAFVIVVAVSVIMVIYLLPRCTFTKEGCHKKNQSIGL IQPFATNGKLFPWAQIRLPTAVVPLRYELSLHPNLTSMTFRGSVTISVQA LQVTWNIILHSTGHNISRVTFMSAVSSQEKQAEILEYAYHGQIAIVAPEA LLAGHNYTLKIEYSANISSSYYGFYGFSYTDESNEKKYFAATQFEPLAAR SAFPCFDEPAFKATFIIKIIRDEQYTALSNMPKKSSVVLDDGLVQDEFSE SVKMSTYLVAFIVGEMKNLSQDVNGTLVSIYAVPEKIGQVHYALETTVKL LEFFQNYFEIQYPLKKLDLVAIPDFEAGAMENWGLLTFREETLLYDSNTS SMADRKLVTKIIAHELAHQWFGNLVTMKWWNDLWLNEGFATFMEYFSLEK IFKELSSYEDFLDARFKTMKKDSLNSSHPISSSVQSSEQIEEMFDSLSYF KGSSLLLMLKTYLSEDVFQHAVVLYLHNHSYASIQSDDLWDSFNEVTNQT LDVKRMMKTWTLQKGFPLVTVQKKGKELFIQQERFFLNMKPEIQPSDTSY LWHIPLSYVTEGRNYSKYQSVSLLDKKSGVINLTEEVLWVKVNINMNGYY IVHYADDDWEALIHQLKINPYVLSDKDRANLINNIFELAGLGKVPLKRAF DLINYLGNENHTAPITEALFQTDLIYNLLEKLGYMDLASRLVTRVFKLLQ NQIQQQTWTDEGTPSMRELRSALLEFACTHNLGNCSTTAMKLFDDWMASN GTQSLPTDVMTTVFKVGAKTDKGWSFLLGKYISIGSEAEKNKILEALASS EDVRKLYWLMKSSLNGDNFRTQKLSFIIRTVGRHFPGHLLAWDFVKENWN KLVQKFPLGSYTIQNIVAGSTYLFSTKTHLSEVQAFFENQSEATFRLRCV QEALEVIQLNIQWMEKNLKSLTWWL
Mehanizam thumb|448x448px|Slika 1. Kristalna struktura IRAP-a u različitim konformacijama. Četiri domena su prikazana zelenom, ljubičastom, cijan i narandžastom bojom za domen I, II, III i IV. Atom cinka je prikazan kao crvena sfera, a spojevi kokristalizirani s enzimom su prikazani žutom. A. Kristalna struktura u zatvorenoj konformaciji (PDB ID 4P8Q), B. Kristalna struktura u otvorenoj konformaciji (PDB ID 5C97), C. Kristalna struktura s linearnim peptidnim analogom (PDB ID 4z7i). Enzim se nalazi u poluzatvorenoj konformaciji, D. Kristalna struktura s makrocikličkim peptidnim inhibitorom (PDB ID 6YDX). Enzim se nalazi u zatvorenoj konformaciji nakon vezivanja inhibitora.IRAP1 koristi katalitski mehanizam sličan onome predloženom za LTA4 hidrolazu. Usvaja termolizinsku strukturu i kristaliziran je u dvije različite konformacije, otvorenoj i zatvorenoj (Slika 1). IRAP je jedina dokumentovana M1 aminopeptidaza koja može cijepati cikličke peptide poput vazopresina i oksitocina. Izrazita konfiguracija GAMEN motiva u IRAP-u generira dodatni prostor oko ostataka 3 i 4 vezanog linearnog peptida, koji bi se mogao koristiti za smještaj većih bočnih lanaca, što bi moguće omogućilo širu selektivnost za peptide. Atomske interakcije između liganda i IRAP-a mogu promovirati konformacijsko zatvaranje. Otvorena konformacija je odgovorna za početno hvatanje supstrata, što može izazvati daljnje zatvaranje koje pojačava interakcije i olakšava katalizu. Struktura IRAP/ligand-vezan ima značajne razlike u poređenju sa "otvorenom" strukturom i strukturom IRAP/peptid. Domen IV pronađen je u suprotstavljenom položaju naspram domena I/II, što je rezultiralo potpunim isključivanjem unutrašnje šupljine iz vanjskog rastvarača. Nedavno je riješena kristalna struktura IRAP-a s makrocikličkim peptidnim inhibitorom, identificirajući nekoliko ključnih karakteristika mehanizma inhibicije. Bliska jukstapozicija GAMEN-petlje na vezanom inhibitoru ne dozvoljava prostor za kretanje molekula vode da interaguju s ioniziranim karboksilatom ostatka aktivnog mjesta Glu (Glu465). Sinergija dva mehanizma, stabilizacija zatvorene konformacije i isključivanje katalitske vode pomoću čvrsto postavljene GAMEN-petlje, predložena je kao mehanizam inhibicije. Štaviše, M1 aminopeptidaze koriste tirozinski ostatak u aktivnom mjestu za stabilizaciju prelaznog stanja. U slučaju IRAP-a, katalitički Tyr549 se nalazi u različitim orijentacijama u otvorenim i zatvorenim konformacijama. Na primjer, u slučaju fosfinskih pseudopeptidnih inhibitora, koji oponašaju prelazno stanje peptidnih supstrata, Tyr549 mijenja orijentaciju nakon vezivanja liganda kako bi interagovao sa jednim od atoma kisika fosfinske grupe, što je ekvivalentno atomima kisika supstrata u prelaznom stanju.
Interakcije Prijavljeno je da IRAP interaguje putem svoje citoplazmatskog domena sa različitim proteinima uključenim u vezikularni transport, vezivanje organela i remodeliranje citoskeleta. Ovi proteini uključuju tankyrazu-1, tankyrazu-2 i p115, koji regulišu transport Golgijevih vezikula; vimentin, intermedijarni filament citoskeleta; i protein FHOS koji remodelira aktin. Nadalje, utvrđeno je da se IRAP povezuje sa AS160/Tbc1d4, proteinom koji aktivira Rab GTPazu (GAP) specifičnim za Rab8, 10 i 14. Ovo ukazuje na to da IRAP ima ulogu u regrutovanju AS160 na endocitne membrane.