La prova del rosa de Bengala és una prova basada en l'aglutinació dels anticossos amb els antígens. Àmpliament utilitzada en el diagnòstic ràpid com a primera prova o sondeig, principalment es fa servir per a determinar la presència de Brucella abortus. És un test qualitatiu que només permet distingir entre individus positius i negatius.
El rosa de Bengala (4,5,6,7-tetracloro-2',4',5',7'-tetraiodofluoresceina) va ser preparat per primera vegada l'any 1884 per Gnehm com a tint de llana que combinava halògens amb fluoresceïna i 4 àtoms de iode. El primer informe d'ús clínic data de l'any 1914 quan Römer va afegir rosa de Bengala a safranina victòria groga per tractar la infecció pneumocòccica ocular. El seu nom es deu a la tonalitat rosa que adquireixen els resultats en els quals apliquem el compost. miniatura|Molècula del rosa de Bengala: 4,5,6,7-tetracloro-2',4',5',7'-tetraiodofluoresceina el rosa de Bengala és estudiat també com a tractament per a certs tipus de càncer i malalties de la pell. Es fan assajos clínics per melanomes, càncers de mama i també se'l investiga per l'èczema i la psoriasi. Amb gotes de seva sal de sodi es pot identificar danys a l'ull, car tenyeixen les zones danyades de la capa conjuntiva i les cèl·lules de la còrnia. miniatura|Imatge d'un Spinoloricus tenyit amb rosa de Bengala (microscopi òptic)
Immunologia (serologia) Diagnòstic de la brucel·losi (principalment bovina) La prova del rosa de Bengala s'utilitza molt en el diagnòstic de la brucel·losi (en els humans coneguda com a febre de Malta) per ser ràpic, senzill i eficaç. És un test molt específic i sensible. S'utilitza principalment com a aproximació diagnòstica immediata. Aquests dos factors en fan una bona prova de cribratge inicial. Els falsos negatius es limiten a malalts amb processos de pocs dies d'evolució.
Va ser recomanada per la FAO/OMS (1986) per al Comitè Mixt d'Experts en Brucel·losi.
Aquest test en el diagnòstic de brucel·losi, és una prova senzilla de ràpida aglutinació puntual en porta. És una prova fonamentalment qualitativa, perquè a partir de la barreja del sèrum reactiu sense diluir humà o animal, posat en contacte amb una suspensió bacteriana com a antigen barrejada amb el colorant, és capaç de detectar la presència o absència d'anticossos contra Brucella.
Aquesta prova d'aglutinació permet un diagnòstic immediat, normalment s'utilitza com a antigen una suspensió bacteriana de cèl·lules mortes de B. abortus biotipus 1 (cepa S99 o S1119-3), a la qual s'afegeix el colorant rosa de Bengala, i a aquest se l'enfronta al sèrum problema sense diluir del possible afectat.
La B. abortus afecta majoritàriament bestiar boví, tot i que també pot afectar l'ésser humà, la biovarietat 1 és la més maligna per a aquest, seguida de la 3 i la 6. Però la B. melitensis és considerada més patògena per a l'home.
Producció d'antigen i procediment de la prova Segons el manual de brucel·losi bovina de l'OIE, l'antigen es prepara recollint per centrifugació a 23000 g (unitat d'acceleració de la gravetat) durant 10 minuts a 4°C les cèl·lules mortes de B. abortus i resuspenent-les uniformement en una solució fenicada a proporció d'1g per cada 22,5 ml. A aquesta suspensió s'afegeix el rosa de Bengala (per cada 35 ml de suspensióhi afegim 1 ml de rosa de Bengala a l'1% en aigua destil·lada) i s'agita la barreja durant dues hores a temperatura ambient. Aquesta es filtra per llana de cotó i se centrifuga a 10.000 G (unitat d'acceleració de la gravetat) per dipositar les cèl·lules tenyides, que a continuació es resuspendran a raó d'1 g de cèl·lules per cada 7 ml de diluent (21,1 g d'hidròxid sòdic dissolts en 353 ml de solució salina amb fenol més 95 ml d'àcid làctic, que s'ajusta a 1056 ml amb solució salina fenicada). La suspensió es filtrarà per llana un cop més i dues vegades a través d'un prefiltre de fibra de vidre. El color de la suspensió ha de ser vermell intens i el sobrenedant d'una mostra centrifugada no ha de tenir colorant. El resultat final serà una solució tamponada amb un pH de 3,65, oscil·lant +/- 0,05, per al seu millor rendiment. Aquest es guarda a 4°C en la foscor. Per fer el test es diposita una gota del «colorant preparat» (antigen) i una de sèrum en un portaobjectes, a temperatura ambient. El portaobjectes s'ha d'inclinar repetitivament en totes direccions per a barrejar així les gotes, el procediment durarà uns minuts.
A la fi de la prova, si l'individu està infectat, els seus anticossos IgG o IgM amb aglutinines específiques presents en el sèrum reaccionaran enfront de l'antigen homòleg (aglutinogen) i formaran aglutinacions. Si en reaccionar a simple vista s'observen petits grumolls com grans de sorra o un gruixut anell en la perifèria de la gota, la reacció és positiva i, per tant, l'individu probablement és malalt (Poden donar-se falsos positius en cas d'infeccions anteriors, el que és un gran problema en àrees endèmiques). Si no s'observa cap d'aquests canvis, la mostra segurament és negativa (no té una especificitat del 100%). La capacitat de reaccionar amb anticossos IgG o IgM és molt útil per al diagnòstic d'individus en fase crònica de la malaltia, ja que aquests presenten un alt nivell d'anticossos IgG difícilment detectables pel tradicional mètode d'aglutinació en tub conegut com a Wright, que permet també la detecció en cas d'infeccions subclíniques.
La reacció de la prova enfront dels sèrums positius (presència de grumolls o anell) és deguda al fet que la unió antigen-anticòs és insoluble i tendeix a precipitar. La precipitació té lloc quan la proporció antigen/anticòs és prou gran (però no sobrepassa el límit) i quan els anticossos bivalents són capaços d'aglomerar l'antigen insoluble fins al punt de formar aglutinacions visibles, gràcies a aglutinines específiques. Si la proporció antigen/anticòs sobrepassa un cert nivell, la capacitat de l'anticòs per aglomerar l'antigen disminueix i l'eficiència del test comença a decaure (augmenten els falsos negatius, aspecte a tenir en compte).
L'obtenció del sèrum problema, es farà seguint el procediment normal, permetent la coagulació de la sang i eliminant-ne el coàgul..
Inconvenients El test presenta alguns inconvenients tot i els múltiples avantatges que pugui tenir, perquè com qualsevol prova serològica aïllada no és adequada per totes i cada una de les situacions epidemiològiques, i és que no té el mateix valor diagnòstic si es realitza en una àrea endèmica o no. En una àrea endèmica la prova tindrà un valor predictiu positiu relativament baix, ja que hi existeix un elevat percentatge d'individus sans que presenten els anticossos contra Brucella per haver-la patit amb anterioritat, per tant seran falsos positius. En aquest cas, el test tindrà baixa especificitat, i és que aquest no permet quantificar la quantitat d'anticossos, sinó simplement la presència, per tant no permet distingir entre una positivitat deguda a la malaltia activa o un estat immunitari per infecció anterior. Això ens obliga a utilitzar altres proves quantitatives per a verificar els resultats, com ara la seroaglutinació en tub la qual ens aporta una aproximació millora de la quantitat d'anticossos. En una zona no endèmica el test té un elevat valor predictiu positiu, la qual cosa permet que un resultat positiu sigui pràcticament diagnosticat, mentre que la probabilitat que apareguin falsos negatius i s'exclogui la malaltia. En aquestes zones l'especificitat del test serà elevada i la sensibilitat més baixa, contràriament al que passaria en una zona endèmica.
Oftalmologia Diagnòstic de la síndrome de l'ull sec El colorant rosa de Bengala tenyeix de vermell les cèl·lules epitelials corneals mortes, necròtiques, desvitalitzades o les quals estan morint, i el mucus. Pren d'aquesta manera, el nom de «coloració vital». Permet, gràcies a un patró característic de tinció, la confirmació del diagnòstic de la queratoconjuntivitis seca (síndrome de l'ull sec) fins i tot, abans que aparegui dany cel·lular manifest.
La síndrome de l'ull sec té deficiència o anomalia de la pel·lícula lacrimal precorneal, promou la necrosi i la descamació de l'epiteli corneal i conjuntival, i la retenció de moc en el sac conjuntival. El colorant també tenyeix els filaments i les plaques corneals, permet observar les zones amb absència de mucina, signe característic de les cèl·lules no sanes. Així doncs, podrem establir amb més precisió el dany a la conjuntiva o a la còrnia ocasionat per la disminució de la producció de llàgrimes.
Les cèl·lules sanes no capten el colorant, perquè algunes substàncies lacrimals el bloquegen, com ara la mucina, l'albúmina, la lisozima i la lactoferrina. En les zones on la pel·lícula lacrimal no sigui íntegra o hi hagi una disfunció en la producció dels seus components, el colorant rosa de Bengala podrà penetrar la superfície ocular, on tenyirà principalment els nuclis cel·lulars i en menor grau altres orgànuls. Aquest mateix test es pot utilitzar també per a verificar el diagnòstic de la Síndrome de Sjögren (tenir els ulls secs és un dels seus símptomes).
Procediment de la prova El rosa de Bengala en el diagnòstic de l'ull sec, es presenta en forma de gotes oftàlmiques que s'apliquen soles directament a l'ull o amb prèvia aplicació d'un anestèsic tòpic. Aquest anestèsic és aconsellable pel principal inconvenient del rosa de Bengala (porsteiorment explicat): la irritació conjuntival. O si no volem aplicar l'anestèsic, podem reduir fins al 0,25% la concentració per la mateixa raó (irritació), ja que la concentració que s'utilitza normalment és de l'1%.
La prova ha estat estandarditzada pel comité del National Eye Institute amb la indicació de fer-ho de la següent manera: Aplicació prèvia de l'anestèsic tòpic Aplicació de 5 μL de rosa de Bengala. (Les gotes poden ser d'entre 2 i 5 μL.) Examinació del pacient a través de la llum de fenadura amb el filtre verd. El colorant deixarà una taca de forma temporal en les cèl·lules de l'ull que estiguin cobertes inadequadament per la pel·lícula lacrimal. Es qualificarà l'afectació segons el grau de tinció i el número del total d'àrees infectades.
Com s'interpreta? La zona exposada de la superfície ocular la dividim en tres sectors: Conjuntiva nasal, conjuntiva temporal i còrnia. Graduem la tinció de cada un de 0 a 3 segons el criteri de Van Bijsterveld. Si sumem els tres valors i obtenim una puntuació superior a 3,5: és un cas de síndrome d'ull sec.
Característiques de la prova La sensibilitat és del 25% (molt baixa), ja que la pigmentació fa que no es vegi perfectament la tinció del rosa de Bengala. L'especificitat és del 90%.
Inconvenients Per tot això comentat, la prova resulta molt útil per a mesurar la integritat de la pel·lícula lacrimal, perquè quan aquesta disminueix, permet la tinció de les cèl·lules epitelials. De la mateixa manera, com també una lesió epitelial que modifiqui la capacitat d'interacció amb la capa de mucosa pot donar una tinció positiva.
El rosa de Bengala no tenyeix les cèl·lules sanes. A més a més, té una toxicitat intrínseca que indueix a la pèrdua immediata de vitalitat de les cèl·lules que no eren correctament protegides per la pel·lícula lacrimal. Aquesta toxicitat pot complicar els diagnòstics d'altres malalties que depenen de l'obtenció de cultius de virus o bacteris que es troben en la superfície ocular, que es veuran afectats per la toxicitat. També és irritant i pot induir a falsos positius, i això disminueix l'especificitat del test.
Un altre inconvenient és que el rosa de Bengala és molt rar que es fabriqui per fer aquesta mena de prova oftalmològica, ja que és contaminant, entre altres motius.
Actualment El rosa de Bengala ha estat substituït pel fluotest que és fluoresceïna i oxibuprocaina (un anestèsic, que es continua a posar, perquè la manipulació dels ulls és molt molesta pel pacient) o pel verd de lisamina que fan la mateixa funció que feia el rosa de Bengala, ajuden i contribueixen a l'exploració ocular.