Cronobacter sakazakii és una espècie de bacteri gramnegatiu de la família de les enterobacteriàcies (Enterobacteriaceae). Definit com a espècie per Farmer et al. al 1980, va ser classificat i caracteritzat definitivament per Iversen et al. l'any 2007. Es tracta d'un bacil anaerobi facultatiu, fàcilment identificable per ser l'única espècie del gènere, que forma colònies de color groga. Aquesta identificació es pot perfilar mitjançant proves bioquímiques i/o moleculars.
Aquest microorganisme es caracteritza per la gran capacitat de formar biofilms i la seva resistència a un ampli interval de temperatures i a la dessecació, la qual cosa li permet estar present en la llet en pols. Fent servir aquest aliment com a mitjà principal de transmissió, actua com a patogen oportunista emergent que causa malalties greus a nounats (com pot ser la meningitis bacteriana), podent portar, en molts casos, a la mort del nounat. Al llarg de la història, són bastants els brots alimentaris causats per aquest bacteri. La detecció d'aquesta infecció es realitza mitjançant cultiu al laboratori amb el suport d'altres tècniques bioquímiques i moleculars, així com altres proves hospitalàries complementàries. Un cop diagnosticat, es subministra un tractament amb antibiòtics d'espectre ampli, que es pot perfilar amb la realització de proves de resistència. Tot i així, la millor manera d'evitar futures infeccions és sempre aplicar les mesures de prevenció indicades. Cal fer ús dels criteris microbiològics encertats que s'aplicaran en tot el procés de producció, distribució i, també, en el tractament del producte alimentari per part del consumidor. Aquests criteris tracten d'assegurar l'absència d'aquest patogen oportunista en l'aliment.
Taxonomia Cronobacter sakazakii pertany al fílum Proteobacteria, a la classe Gammaproteobacteria, ordre Enterobacterales, família Enterobacteriaceae i gènere Cronobacter. Aquest gènere consta de 7 espècies encara que l'espècie més relacionada amb brots alimentaris és C. sakazakii.
La relació taxonòmica entre les diferents espècies de Cronobacter es va basar en estudis que van utilitzar tota la seqüència genètica d'ARN ribosòmic 16S, amb hibridació DNA-DNA, la identificació seqüencial de multilocus (MLST), la f-AFLP, i la tècnica del ribotyping. Com a resultat es va concloure que hi havia una nova espècie dins del gènere (Cronobacter sakazakii).
Història El primer aïllat conegut d'aquest bacteri es remunta a l'any 1950, quan una soca de la família de Enterobacteriaceae va ser aïllada d'una llauna de llet en pols. Aquesta soca va ser enviada i identificada a l' "England's National Collection of Type Cultures" (NCTC).Entre els anys 1950 i 1980 es van aïllar diferents microorganismes, tots ells referits sota l'expressió "Enterobacter cloacae amb pigment groc", que es podria considerar el primer nom donat a l'actual Cronobacter sakazakii.
L'any 1980, Farmer et al. van reclassificar tots aquests aïllats com una nova espècie, Enterobacter sakazakii, d'acord amb les normes del Codi Internacional de Nomenclatura de Procariotes i, per tant, donant-li un nom científic vàlid. Es va anomenar "Sakazakii" en reconeixement del microbiòleg japonès Riichi Sakazaki.
L'any 2007, Iversen et al. van proposar el nou gènere Cronobacter i van fer estudis genètics de les soques identificades, fins a aquell moment, com a Enterobacter sakazakii. L'espècie Enterobacter sakazakii es va reanomenar Cronobacter sakazakii, dins del gènere Cronobacter. Els bacteris inclosos en aquest gènere es caracteritzen per causar infeccions letals en nounats, per aquest motiu, es va anomenar aquest gènere com Cronobacter, en relació al deu grec Cronos, que matava i s'empassava als seus fills tan aviat com naixien.
Avui en dia, dins d'aquest gènere hi podem trobar 7 espècies diferents.
Identificació Cronobacter sakazakii és un bacil anaerobi facultatiu, gramnegatiu, oxidasa negatiu, catalasa positiu, redueix nitrats i generalment té α-D-glucosidasa. No forma espores, encara que és força resistent a estrès osmòtic i sequera i és un microorganisme mòbil ja que normalment presenta flagels.
Tenint en compte aquestes característiques, s'han desenvolupat diversos protocols per dur a terme l'aïllament i la caracterització de Cronobacter sakazakii. Els dos protocols més recents han estat desenvolupats per la FDA, l'Organització Internacional per a l'Estandardització i la Federació Nacional de Productes Làctics. El mètode de la FDA inclou una etapa de pre-enriquiment que dura entre 6-24h, seguida d'un enriquiment selectiu i un aïllament a partir del qual podem fer una identificació de les colònies gràcies a proves bioquímiques i mètodes moleculars com PCR, entre d'altres.
Etapa de pre-enriquiment En aquesta primera etapa, en la qual es tracta d'estimular el creixement de Cronobacter sakazakii, s'utilitza el brou específic d'enriquiment Cronobacter (CEB) que ajuda a disminuir el temps de detecció del bacteri, ja presenta característiques que afavoreixen la seva proliferació.
Aïllament A continuació del pre-enriquiment, es poden utilitzar diferents medis d'aïllament d'aquest microorganisme, per tal de seleccionar el creixement de les seves colònies en concret. Existeixen medis més generals com el medi Mc Conkey, que afavoreix el creixement d'enterobacteris. També es poden utilitzar medis cromogènics i altres més específics pel gènere Cronobacter basats en l'enzim α-glucosidasa i β-celobiosidasa com, per exemple, Leuschner-Bew agar, druggan Fosythe-Iversen agar o Kang Oh-agar. En aquests medis poden créixer més microorganismes del gènere Cronobacter i, per tant, caldrà identificar posteriorment les colònies.
En concret, el protocol de la FDA es basa en la utilització d'agar cromogènic DFI i agar R&F que s'incuba entre 18-24h. Normalment, s'identifiquen les colònies en placa, ja que Cronobacter sakazakii és l'única espècie del gènere que dona lloc a colònies grogues.
Proves bioquímiques A partir de colònies aïllades en placa es poden dur a terme diferents proves bioquímiques, per tal de caracteritzar l'aïllat, si es tracta de Cronobacter sakazakii, s'obtindran els següents resultats: +ProvaResultatCatalasa +Oxidasa -Reducció de nitrats +Hidròlisi d'esculina +Fermentació de lactosa + A part d'aquestes proves, es poden dur a terme altres relacionades, principalment, amb el metabolisme de sucres. Això permetrà, per exemple, diferenciar C.sakazakii d'altres espècies del mateix gènere.
Mètodes moleculars Un dels mètodes més utilitzats per a la identificació de C.sakazakii a nivell molecular és la PCR. Normalment, es fa servir real time PCR (RT-PCR) per la detecció ràpida d'aquest microorganisme i, a més, permet dur a terme un recompte en mostres de llet pasteuritzada. És una tècnica ràpida i específica amb la qual s'obtenen resultats fiables. No obstant, en el protocol de la FDA s'estableix que s'ha de realitzar una PCR normal per duplicat a partir de mostra. Si qualsevol de les dues dona resultats positius s'ha de confirmar utilitzant els medis de cultiu adients, per contra, si els dos resultats són negatius, s'atura l'anàlisi.
També es poden utilitzar altres mètodes alternatius com whole-genome sequencing (WGS) que consisteix en l'extracció dels àcids nucleics presents en una mostra de llet, la preparació de les llibreries genòmiques i la posterior seqüenciació de tots els àcids nucleics. Això, permet fer una identificació fiable del microorganisme. No obstant, és una tècnica més costosa econòmicament pels laboratoris, ja que requereix d'unes instal·lacions específiques de preu molt elevat. Per altra banda, una altra tècnica que es pot utilitzar per a la identificació del microorganisme és la PFGE. Consisteix a deixar créixer les colònies, extreure el DNA i deixar-ho incubar amb enzims de restricció. Posteriorment, es fa una electroforesi en gel 1% agarosa i es visualitza el resultat sota llum UV. En funció dels patrons obtinguts en aquesta electroforesi, es poden identificar les diferents espècies de Cronobacter, entre elles C.sakazakii. Finalment, també mencionar la MLST que consisteix en identificar diferents al·lels d'uns determinats gens per saber quina espècie de Cronobacter tenim en la nostra mostra. En el cas de Cronobacter, s'utilitzen els següents gens: atpD, fusA, glnS, gltB, gyrB, infB.
Ecologia Cronobacter sakazakii es considera un bacteri ubic i mòbil, que es pot trobar en indrets molt variats com poden ser sòls, aigua, superfícies de vegetals, animals o en superfícies d'hospitals. Destaca, sobretot, la presència d'aquest gramnegatiu en els aliments, on actua com a contaminant ocasional. Aquest microorganisme ha estat aïllat en gran quantitat d'aliments, tant d'origen vegetal com animal i, fins i tot, en productes que han estat tractats (fumats, congelats, deshidratats...). És remarcable la seva presència en la llet en pols, on pot romandre present fins a 2 anys. Aquesta ubiqüitat es dona gràcies a la seva capacitat per formar biofilms, així com la seva gran resistència a la dessecació gràcies a la presència d'una càpsula bacteriana molt gruixuda. Aquesta facilitat per sobreviure en ambients secs ve acompanyada de la seva capacitat de créixer en un rang molt ampli de temperatures (entre 6 i 47 °C, tenint com a temperatura òptima 39 °C, tot i que això pot variar lleugerament entre soques).
Cronobacter sakazakii actua com un patogen oportunista que es transmet, principalment, a través dels aliments, causant malalties especialment en nadons, així com en adults immunocompromesos i gent gran. Tots ells coincideixen en presentar un sistema immunitari que no es troba en condicions òptimes.
Patogènesi Cronobacter sakazakii és el responsable d'infeccions que es donen principalment en nadons, sovint associades al consum de preparats infantils de llet en pols, amb una ràtio de mortalitat elevada (40–80%). En ser un patogen oportunista, també pot afectar adults immunodeprimits, amb un sistema immunitari més dèbil. Els grups d'alt risc, però, són els nounats prematurs on produeixen malalties com la meningitis bacteriana, la bacterièmia i l'enterocolitis necrotitzant. Cal destacar que la patogènesi d'aquest microorganisme continua sent pràcticament desconeguda i queda molta informació per conèixer, ja que encara no tenim models animals i eines genètiques adequades que es puguin aplicar.
En els diferents experiments en cultius de línies cel·lulars o bé en rates, s'han observat tres mecanismes principals que afavoreixen el desenvolupament de malalties: la invasió de cèl·lules intestinals, la supervivència en macròfags (pot arribar fins a 48 hores) i la invasió de la barrera hematoencefàlica. Aquests trets no només faciliten la propagació del bacteri pel cos de l'organisme, sinó que també és un mecanisme d'evasió de la resposta immunitària.
Virulència Cronobacter sakazakii es considera un patogen oportunista, que afecta sobretot a nens nounats i, en alguns casos, a adults immunodeprimits. En principi, no causa malaltia en individus sans. De fet, només produeix conseqüències clíniques greus, com meningitis o sepsis, quan és capaç d'arribar a les cèl·lules epitelials de l'intestí i infectar-les directament o bé travessar el teixit per disseminar-se en la sang. Per tal d'aconseguir-ho, el microorganisme utilitza un seguit de factors de virulència. Per l'anàlisi de la virulència d'aquest patogen, cal tenir en compte que els mètodes tradicionals no proporcionen molta informació. Per aquesta raó, s'utilitzen més tècniques de biologia molecular com la PCR, la seqüenciació del RNA o la infecció de línies de cultius cel·lulars intestinals (CACO-2) per observar l'efecte directe sobre les cèl·lules.