La proteïna de fluorescència vermella o RFP (per les seves sigles en anglès Red Fluorescent Protein) representa un grup de proteïnes que emeten fluorescència vermella.
La primera descoberta va ser aïllada del corall Dicosoma i va ser anomenada Ds-Red. Des del seu descobriment, l'any 2002, s'han desenvolupat nous tipus de proteïnes vermelles cada cop més millorades.
La RFP s'utilitza com un marcador biològic. L'adhesió codificada genèticament dels fluoròfors com la RFP a altres proteïnes permet estudiar-les. D'aquesta manera, es poden visualitzar patrons espacials i temporals en la cèl·lula o la localotzació de proteïnes i detectar l'expressió de gens in vivo.
Estructura L'estructura de les RFP depèn molt de la família de la qual formen part, que pot ser la família DsRed o la Kaede. Tot i així, hi ha sectors o característiques que sí que comparteixen.miniatura|Diagrama de cintes de l'estructura de la proteïna Ds-Red
Aquestes proteïnes han evolucionat (ja sigui de manera natural o de forma artificial o induïda) fins a ésser proteïnes amb fluorescència vermella, i el que els dona aquesta característica i, per tant, factor que totes comparteixen, és un cromòfor de formació del tripèptid X-Tyr-Gly. Així, el que totes les RFPs tenen en comú és un anell fenol derivat del residu de la tirosina (Tyr).
A partir d'aquesta informació s'ha pogut deduir que les propietats espectrals dels cromòfors estan força lligades a l'equilibri entre l'estat protonat i desprotonat del grup hidroxil del fenol. Tot i així, cal tenir en compte que el desenvolupament del cromòfor està catalitzat per la proteïna sencera i, per tant, pot sorgir més diversitat a l'espectre.
Com hem dit abans, depenent de la família a la qual pertanyen presentaran unes característiques d'estructura o unes altres, i aquestes estan definides en altres apartats d'aquest mateix article.
Característiques de les RFP Des del seu descobriment s'han elaborat molts tipus de proteïnes vermelles fluorescents amb l'objectiu de trobar cada cop marcadors més òptims, augmentant tant com sigui possible la seva efectivitat i reduint el dany a la cèl·lula. En general, per ser RFPs adequades per a la investigació, han de complir aquestes característiques:
Prou expressabilitat, prou brillants per ser detectades. No citotòxiques. Que no s'oligomeritzin en expressar-se juntament amb altres proteïnes. Han de ser fotoestables. Ha de ser insensibles a factors del medi que puguin alterar els resultats de l'experiment (com el pH molt àcid). Que tinguin mínimes interferències en els seus canals d'excitació i emissió.
Aquí es descriuen aquestes característiques de les RFP.
“Brillantor” i expressió La brillantor de les FP depèn entre altres factors de la velocitat de maduració, coeficient d'extinció i en experiments més llargs de la fotoestabilitat (entre d'altres). Unes de les RFP més brillants són la tdTomato i mStrawberry i la TagRFP.
Moltes RFP sembla que s'expressen a temperatura de 37 graus en cèl·lules de mamífers però hi ha variacions. No s'ha fet estudis intensius sobre les temperatures òptimes d'expressió en aquest tipus de cèl·lules però s'ha vist que en cèl·lules de bacteris l'expressió de les RFP pot ser ineficaç a 37 graus. Tanmateix no s'han d'extrapolar necessàriament a cèl·lules de mamífers aquesta expressió a 37 graus ja hi ha diferències entre ambdós tipus de cèl·lules.
La presència o absència d'oxigen molecular és altre factor que influeix en la maduració de les RFP, ja que és requerit en l'oxidació dels aminoàcids que intervenen en la formació del cromòfor. Una de les conseqüències que té és que genera aigua oxigenada (una molècula en les FP de la medusa Aequorea i dues en les del coralls). A més, això implica que en condicions anòxiques no es generi fluorescència.
Fotoestabilitat Les RFP poden patir fotoblanqueig (Photobleaching), és a dir, pèrdua de fluorescència per degradació fotoquímica del fluoròfor (part de la molècula que fa que aquesta sigui florescent) té lloc sovint en un rang d'excitació més ample que a altres molècules colorades més petites. La fotoestabilitat és una de les característiques per triar la RFP amb què treballar (tot i que no en tots decisòria) i se sol mesurar estudiant les corbes de fotoblanqueig. Unes gotetes amb RFP que simulen el volum que tenen les cèl·lules de mamífer són observades a microscopi de fluorescència i exposades a llum contínuament per induir el fotoblanqueig, aleshores, se’n recullen periòdicament imatges per elaborar les corbes de fotoblanqueig. Per exemple, la mCherry i la tdTomato tenen alta fotoestabilitat.
Aquest estudi té la seva limitació, ja que es basa en les il·luminacions que es fan servir en els típics microscopis estàndards d'epifluorescència però potser no serien vàlids en altres microscopis que funcionin amb llum de més intensitat com ara els microscopis làser confocals. En aquest cas s'ha vist per exemple que la mRFP1, tot i que es degrada per fotoblanqueig més ràpid que la mCherry quan s'utilitzen microscopis de fluorescència més convencionals, en observar-se amb el microscopi làser confocal sembla que tingui la mateixa velocitat de fotoblanqueig que la mCherry. Un altre exemple és la TagRFP, que té fotoestabilitat mitjana, però és molt més gran en observar-la al microscopi confocal.
Oligomerització i citotoxicitat Abans sovint hi havia problemes amb l'oligomerització de les proteïnes vermelles fluorescents silvestres, ja que moltes són dímers o tetràmers (és exemple la primera DsRed del Dicosoma) però al llarg del temps s'han anat modificant i es van elaborar monòmers o dímers en tàndem (que vol dir que funcionalment són monòmers però que tenen el doble de pes molecular).
Les RFP normalment no són citotòxiques, però en cas d'alguns models nous, no se sap si poden arribar a ser-ho. Algunes RFP tetramèriques semblen tòxiques pels bacteris però les monomèriques en general no són tòxiques.
Marcatge múltiple (Multiple labeling) Les RFP les podem fer servir combinades amb altres colors de fluorescència. Quan volem marcar una mateixa cèl·lula amb FP de diferents colors hem d'aconseguir que els seus espectres d'emissió no se solapin. D'aquesta manera es podran distingir bé. Tot i que utilitzar les diferents FP individualment ens permet distingir en un ample marge de l'espectre, també podem fer servir 3 o 4 FP combinades gràcies a conjunts de filtres, com per exemple quan combinem Cerulean or CyPet, any YFP, mOrange o mKO i mCherry. Per aconseguir-ho se'ls ha de donar una energia d'excitació determinada, diferent de la que donaríem a la mateixa FP si la féssim servir individualment.
Tipus Després del descobriment de la primera proteïna fluorescent, la GFP (proteïna de fluorescència verda), per Osamu Shimomura (Douglas Prasher va descobrir el seu potencial com a marcador), es va mutar i estudiar aquesta proteïna per poder trobar altres tonalitats de colors fluorescents.
La mutació de la GFP de Aequorea victroria va donar resultats i es van trobar noves emissions que anaven del blau al groc, però en cap cas es va trobar cap tonalitat vermella.
Més endavant els científics Sergey Lukyanov i els seus col·laboradors van intentar trobar anàlegs semblants a la GFP en els coralls fluorescents. Efectivament van trobar sis proteïnes del corall semblants a la GFP. Quatre d'elles emetien un rang verd-groc, una blau, i finalment, la sisena emetia un rang vermell.
La proteïna que emetia dins del rang vermell era de l'espècie del corall Discosoma i la van anomenar DsRed.
D'aquí sorgeix la primera família de proteïnes de fluorescència vermella, la família DsRed: Família DsRed La DsRed té una fosforescència de color vermella ataronjat amb una emissió màxima a 583 nm. Gràcies als estudis cristal·logràfics i de raigs-X s'ha pogut veure que la DsRed forma un tetràmer estable, i que cada monòmer és estructuralment molt similar a la GFP.
La fluorescència de la DsRed està excitada òptimament a 558 nm, però també pot ser excitada per un estàndard de 488 nm làser. A més és una molècula amb un rendiment quàntic alt i és fotosestable. Tot plegat fa que la molècula sigui ideal per la formació d'imatges de fluorescència. miniatura|Proteïna DsRedMalgrat les seves característiques, la DsRed de tipus silvestre té problemes pel seu ús com a indicador fluorescent. Quan aquesta és fusionada amb una altra proteïna, la tetramització del domini DsRed pot pertorbar la funció i localització de la proteïna 14. El tetràmer de DsRed també s'autoassocia per formar agregats d'ordre superior.
El major problema de la DsRed és que la maduració del cromòfor és molt lenta, ja que té un temps mitjà de més de 24 hores a una temperatura ambient 2,15. Això vol dir que la DsRed acabada de sintetitzar desenvolupa la mateixa fluorescència que verda que un cromòfor de la GFP. Una segona oxidació (requereix molt de temps) és la que produeix el cromòfor vermell.
Una variant d'aquesta família anomenada DsRed2 madura molt més ràpid que la DsRed1, però requereix moltes més hores per assolir la màxima fluorescència del cromòfor.
S'ha intentat amplificar la plantilla de DsRed1 amb plasmidis mutants fent servir errorprone PCR. Aquest estudi es va dur a terme en colònies de E. Coli, i es va observar que les que produïen DsRed1 tipus salvatge necessitava dos dies per desenvolupar una fluorescència significativa, però tres colònies mutants mostraven la fluorescència després d'un dia, i van ser les que tenien un canvi en la cadena N42H. I aquesta va ser la base per formar una proteïna mutant amb una maduració més ràpida.
La conseqüència de la N42H és que emetia més pics de fluorescència verds i blaus que l'original (en proporció amb els vermells) i, per tant, alterava el seu espectre d'emissió. Per tant, es va fer un segon canvi N42Q per reduir la cadena lateral, ja que la N42H l'augmentava considerablement. El resultat amb el segon canvi va ser una proteïna que seguia tenint una ràpida maduració (N42H) i a més menys excitació verda i blava.
Per tal de millorar l'eficàcia de la proteïna es va seguir mutant per trobar alguna amb una maduració més ràpida i una menor emissió verda. Es van trobar tres derivades: DsRed.T1, DsRed.T3 i DsRed.T4 (similars a DsRed1 tipus salvatge), totes tres més brillants, però amb més excitació blava i verda (pic emissió més gran).
Si comparem totes les variants trobades fins ara observem que DsRed2 té un quoficent d'extinció més petit que la DsRed1, fet que comporta que aquesta última sigui més brillant. Després tenim la DsRed.T3, que és quasi tan brillant com la DsRed1. I en canvi DsRed.T1 i DsRed.T4 tenen una brillantor relativa en comparació amb DsRed1 de 0.36 i 0.38 respectivament, per tant bastant menys brillants.
Posteriorment es va fer un estudi per qualificar el temps de maduració de cadascuna de les variants trobades. Es va obtenir que la DsRed1 madurava amb un període d'11 hores, la DsRed2 (una mica més ràpida) amb un de 6,5 hores, la DsRed.T3 amb un d1,3 hores, i la DsRed.T4 i DsRed.T1 amb un temps mitjà més o menys de 0,7 hores (15 vegades més ràpid que el de DsRed1). Variant DsRedPeríode de vidaDsRed111 horesDsRed26,5 horesDsRed.T31,3 horesDsRed.T10,7 horesDsRed.T40,7 hores
Classificació variants DsRed En resum, el resultat dels experiments amb totes aquestes variants van classificar-les de la següent manera: Variant DsRedExcitació màximaEmissió màximaQuoficient d'extinció màxim (M-1·cm-1)Rendiment quànticBrillantor relativaPeríode de maduracióDsRed1558 nm583 nm52,0000,681.0011 horesDsRed2561 nm587 nm43,8000,550,686,5 horesDsRed.T1554 nm586 nm30,1000,420,360,70 horesDsRed.T3560 nm587 nm49,5000,590,831,3 horesDsRed.T4555 nm586 nm30,3000,440,380,71 hores A part de la família DsRed, s'ha trobat una altra amb la mateixa tonalitat vermella. Aquesta s'anomena família Kaede:
Família Kaede