La papaïna o papaia proteïnasa 1 (PP1) és una proteasa d'origen vegetal present al làtex de la planta de la papaia (Carica papaya), que s'utilitza àmpliament en la indústria alimentària i de begudes per estovar la carn i solubilitzar agregats proteics, així com en la indústria farmacèutica, biomèdica i cosmètica.
És un dels principals components proteínics del papaier (arbre de la papaia) i de gran importància comercial gràcies a la seva activitat proteolítica en una gran varietat de substrats proteics i al fet de ser activa en condicions molt diverses.
Origen Aquest enzim està present en el fruit, fulles i arrels de la planta de la papaia (Carica papaya), concretament en el làtex, un fluid lletós de defensa que genera el propi vegetal de forma natural per combatre plagues d'insectes i fongs.
Classificació i nomenclatura enzimàtica El codi enzimàtic de la papaïna és EC 3.4.22.2. Aquesta classificació es regeix segons el següent criteri:
Tipus de reacció que catalitzen (classe): pertany al grup de les hidrolases (classe 3) ja que catalitza reaccions d'hidròlisi, és a dir, de degradació mitjançant aigua com a reactiu. Tipus d'enllaç que hidrolitzen (subclasse): enllaços peptídics (subclasse 4), d'aquí que també se’n faci referència com a hidrolasa peptídica o peptidasa. Aquesta divisió a més es subdivideix en exo- i endoproteases. La papaïna és una endopeptidasa i com a tal, actua sobre les regions internes de les cadenes polipeptídiques, en contraposició a les exopeptidases que ho fan sobre zones terminals. Naturalesa del centre actiu (sub-subclasse): el centre actiu conté un residu de cisteïna que aporta un grup sulfhidril lliure necessari per la catàlisi enzimàtica. Per aquest motiu forma part del grup de les cisteïna proteases (sub-subclasse 22), també conegudes com tiol proteases. Número de sèrie que se l'atorga a l'enzim: és la xifra distintiva que identifica cada enzim dins del grup, per a la papaïna és el número 2.
Estructura La papaïna és un polipèptid no glicosilat d'una sola cadena de 212 aminoàcids que es plega per formar una proteïna globular que conté tres ponts disulfur i està formada per dos subdominis ben diferenciats que es coneixen com L- i R- en referència a la seva posició. El primer (L-) està format majoritàriament per hèlix-α, mentre que el segon (R-) està format per una làmina-β antiparal·lela (que forma el nucli d'aquest subdomini) i dos hèlix-α (situades a la regió superficial en extrems oposats de la làmina-β). Aquesta disposició (L- i R-) possibilita que en la interfície d'aquests subdominis es formi una fenedura en forma de V a la superfície de l'enzim, en la qual els substrats es poden unir (zona activa).
El centre actiu està format per quatre residus: un parell iònic de cisteïna (Cys25) i histidina (His159) i com a suport, un d'asparagina (Asn175) i glutamina (Gln19) per ajudar a estabilitzar l'intermediari enzim–substrat que es forma durant la catàlisi.Els intermediaris de cisteïna i histidina es troben en subdominis oposats (L i R respectivament).
Quant a la seva activitat i especificitat, la papaïna té 7 llocs d'unió al substrat: S1, S2, S3, S4 (localitzades a l'extrem N-terminal del centre catalític) i S1’, S2’, S3’ (localitzades a l'extrem C-terminal del centre catalític). Cadascuna d'aquestes regions superficials és capaç d'associar-se amb un residu d'aminoàcid d'un substrat (P1, P2, P3, P4 i P1’, P2’, P3’) i el seu caràcter específic pels substrats és variable i bastant ampli. Això es deu al fet que la zona on es poden unir els substrats és extensa i hi ha interaccions en molts llocs. De fet, la selectivitat del substrat només està ben definida per a la regió 2 (S2), que té especificitat per substrats que contenen una cadena lateral apolar (hidrofòbica) a la posició P2. Un exemple són la fenilalanina (Phe) i la valina (Val).
Mecanisme d'acció Per a que hi hagi activitat catalítica el grup tiol de l'enzim ha de trobar-se en forma reduïda i per això cal un medi reductor i àcid.
El procés catalític s'inicia amb la unió no covalent de l'enzim lliure i el substrat peptídic, que genera un complex intermediari inestable. Aquest es forma mitjançant l'atac nucleofílic del grup tiol (-SH) de la cisteïna al grup carbonil (C=O) de l'enllaç peptídic del substrat i és estabilitzat pel residu de glutamina (Gln19). Això només és possible si els residus de cisteïna i histidina es troben en forma ionitzada com a ió tiolat (S-) i imidazol (ImH+). A continuació es produeix l'acilació de l'enzim i com a conseqüència es forma i allibera una amina (R’-NH₂). Finalment es produeix una desacilació, en la que el complex acil-enzim reacciona amb una molècula d'aigua per alliberar el grup carboxílic (-COOH) i així regenerar l'enzim lliure. A partir d'aquí es pot iniciar un nou cicle catalític. center|miniatura|927x927px|Esquema del mecanisme d'acció de les cisteïna proteases
Propietats catalítiques La papaïna té un pes molecular de 23,4 kDa i un punt isoelèctric (pI) de 8,75 pel que es considera una proteïna relativament bàsica.
Presenta activitat i estabilitat en un ampli rang de condicions: de pH 5 a 8, sent l'óptim entre 6 – 6,5 i fins a una temperatura de 80 °C, sent l'òptima de 60 °C. Aquesta resistència tèrmica és deguda a la presència dels tres ponts disulfur intracatenaris que estabilitzen l'estructura.
En relació al pH, a valors a prop de la neutralitat mostra una estabilitat tèrmica inusualment alta. En canvi, a pH àcid (< 4) i temperatures elevades, s'inactiva ràpida i irreversiblement.
Quant a solubilitat, és escassament soluble en aigua o a baixes concentracions iòniques, perquè en la seva estructura els residus hidròfobs són més abundants que els hidròfils (encara que la majoria es troben a l'interior de la proteïna).
Fonts i mètodes d'obtenció Natural La papaïna és produïda a les etapes inicials del desenvolupament del fruit i a mesura que aquest madura la seva concentració disminueix. Per aquest motiu per a la obtenció de la papaïna es fa ús de la papaia verda (immadura), ja que conté nivells elevats de la proteasa.
La producció de papaïna de forma industrial comprèn una sèrie de processos diversos: l'extracció (solubilització), la purificació, l'assecatge i l'envasament.
L'extracció de la proteasa comença amb l'obtenció i recollida del làtex de la papaia a partir de la incisió més o menys profunda i longitudinal de la seva pell, evitant fer un tall massa profund ja que pot afavorir l'alliberació de suc i midons juntament amb el làtex i comprometre la seva qualitat. A continuació cal un procés de solubilització mitjançant solvents per a obtenir l'extracte enzimàtic amb la papaïna en forma soluble.
La purificació consisteix en la separació de l'enzim que es vol aïllar de qualsevol matèria indesitjable. L'objectiu és retirar impureses i aconseguir l'homogeneïtat de l'extracte. El correcte i eficient desenvolupament d'aquesta fase és clau, ja que afecta el grau de puresa i rendiment que s'obté, l'activitat de l'enzim i influeix en els costos generals del procés.
Habitualment aquesta etapa es realitza per mètodes convencionals però existeixen altres alternatives més modernes.
Purificació per mètodes convencionals És útil i un bon procediment de pre-purificació per a concentrar i incrementar la recuperació de l'enzim, tot i que és un procés tediós i al involucrar varies etapes resulta en rendiments enzimàtics baixos. Consisteix en una centrifugació i ultrafiltració per membranes.
La centrifugació és el procés pel qual s'eliminen compostos sòlids. Afavoreix la disrupció de les cèl·lules vegetals i l'alliberació dels enzims intracel·lulars sense desnaturalització. Posteriorment és necessària una filtració.
La ultrafiltració és un dels millors mètodes per a concentrar proteïnes i permet eliminar altres soluts de menor pes molecular. Tot i així a l'extracte proteic poden quedar restes de pigments, carbohidrats, fibres i lípids, que s'eliminen utilitzant una mescla d'aigua/alcohol. En aquest cas, s'ha vist que la conformació nativa de la papaïna es veu poc afectada per altes concentracions de solvents orgànics, tot i això convé minimitzar l'ús de dissolvents orgànics.
Purificació per mètodes moderns La partició trifàsica (TPP) es realitza mitjançant la addició d'una sal (sulfat d'amoni (NH4)₂SO4) i un solvent orgànic (terbutanol) a l'extracte enzimàtic. Aquesta sal s'utilitza amb una certa saturació per a precipitar la proteïna (enzim) i el dissolvent s'afegeix per a formar 3 capes: una fase superior (orgànica) i una inferior (aquosa) on queden retinguts els contaminants segons la seva polaritat i una interfase proteica d'on es recuperen les proteïnes diana per precipitació.
La cromatografia d'intercanvi iònic també es basa en les propietats àcid-base de les proteïnes. La fase estacionària consisteix en una columna de resina amb anions i cations ja que les proteïnes són amfòteres i sol ser de carboximetilcel·lulosa (CMC) o dietilaminoetil-cel·lulosa (DEAE-cel·lulosa). La CMC com té càrrega negativa, és un intercanviador de cations feble i la DEAE-cel·lulosa al tenir càrrega positiva, n’és un d'anions.
L'extracció aquosa en dues fases es basa en la transferència de massa entre dues fases líquides immiscibles: una mescla de dos polímers incompatibles (polietilenglicol i dextrà) o d'un polímer i una sal, amb una solució rica en aigua. A l'afegir l'enzim a aquestes fases, mostra afinitat per una de les dues fases permetent la seva separació. En la distribució de l'enzim entre aquestes dues fases influeixen la força iònica, el pH, la temperatura, el pes molecular del polímer i el tipus de sal. Un aspecte molt positiu és que com un 70-80% de les mescles és aigua, redueix la desnaturalització de l'enzim, a més és un mètode econòmic i la separació requereix poc temps.
L'extracció micel·lar inversa produeix la separació de l'enzim d'un dissolvent orgànic en forma de gotes per la presència de tensioactius (micel·les). El que succeeix és que les regions polars (hidròfiles) i no polars (hidròfobes) de la micel·la, indueixen el moviment de la proteïna al seu interior (que sigui solubilitzada). Aquest es veu afectat pel pH, la força iònica de la fase aquosa i la concentració de tensioactius. Té l'avantatge de ser un procés senzill i eficient des del punt de vista energètic, fàcil de traslladar a gran escala i de desenvolupar en continu. Tot i així és difícil recuperar la proteïna del dissolvent que conté restes de tensioactius.
Després de la purificació s'obté una fracció rica en proteasa, que es sotmet a un assecatge per atomització (per esprai) en el que es polvoritza la solució enzimàtica en un flux d'aire calent.
Al final s'obté un extracte en pols blanc o blanc grisós, lleugerament higroscòpic que requereix un envasament amb un material adequat que eviti l'absorció d'humitat.
ADN recombinant Per fer front a l'elevada demanda d'aquest enzim a la indústria, sorgeix una alternativa a la producció per medis naturals: la papaïna recombinant.
La tecnologia d'ADN recombinant es pot aplicar a la producció i modificació d'enzims d'interès alimentari i es basa en la clonació. Primer s'obté el gen que codifica la proteïna d'interès (papaïna procedent de Carica papaya) i després s'insereix en un vector de clonació amb una alta capacitat de replicació (plasmidi). Durant aquest procés a més es poden inserir en el plasmidi elements per facilitar la purificació de l'enzim. Finalment el vector que conté el gen clonat s'introdueix en una cèl·lula hoste (fàbrica cel·lular) que és qui produirà l'enzim desitjat. Aquests hostes acostumen a ser de naturalesa bacteriana (Escherichia coli o Bacillus subtilis) o fúngica (Saccharomyces, Kluyveromyces o Pichia pastoris).