miniatura|Estructura cristal·lina 3D de la bromelaïna|257x257pxLa bromelaïna o bromelina és una proteasa d'origen vegetal procedent de la planta de la pinya tropical (Ananas comosus), que s'utilitza àmpliament en la indústria alimentària i de begudes (com a potenciador del sabor, per estovar la carn o per solubilitzar agregats proteics), així com en la indústria farmacèutica, biomèdica i cosmètica.
El terme 'bromelaïna' també fa referència a l'extracte aquós cru de la tija i el fruit de la pinya, que és una mescla d'enzims proteolítics (bromelaïna de la tija, de la fruita i ananaïna) i d'altres tipus (fosfatases, glucosidases, peroxidases, cel·lulases i glicoproteïnes).
Origen Aquest enzim està present de forma abundant a les diverses parts de la planta de la pinya tropical (Ananas comosus), tot i que en destaca la seva producció en la tija i el fruit (sobre tot en el cor). De fet aquestes dues fraccions permeten distingir-ne dos tipus: la bromelaïna de la fruita i la de la tija. Aquesta última té una major concentració de l'enzim en comparació al fruit i al considerar-se un subproducte del sector de transformació de la pinya, és una font més econòmica d'on extreure’l, motius pels quals se’n fa un ús més ampli a la indústria.
Classificació i nomenclatura enzimàtica Existeix un codi enzimàtic per a cada tipus d'enzim: el de la bromelaïna de la tija (stem bromelain) és EC 3.4.22.32 i el de la de la fruita (fruit bromelain) és EC 3.4.22.33. Aquesta classificació es regeix segons el següent criteri:
Tipus de reacció que catalitzen (classe): pertany al grup de les hidrolases (classe 3) ja que catalitza reaccions d'hidròlisi, és a dir, de degradació mitjançant aigua com a reactiu. Tipus d'enllaç que hidrolitzen (subclasse): enllaços peptídics (subclasse 4), d'aquí que també se’n faci referència com a hidrolases peptídiques o peptidases. Aquesta divisió a més, es subdivideix en exo- i endoproteases. Les bromelaïnes són endopeptidases i com a tals, actuen sobre les regions internes de les cadenes polipeptídiques, en contraposició a les exopeptidases que ho fan sobre zones terminals. Naturalesa del centre actiu (sub-subclasse): el centre actiu conté un residu de cisteïna que aporta un grup sulfhidril lliure necessari per la catàlisi enzimàtica. Per aquest motiu forma part del grup de les cisteïna proteases (sub-subclasse 22), també conegudes com tiol proteases. Número de sèrie que se l'atorga a l'enzim: és la xifra distintiva que identifica cada enzim dins del grup. És 32 en el cas de la bromelina de la tija i 33 en el de la fruita.
Estructura La bromelaïna de la tija és un polipèptid glicosilat que conté manosa, xilosa, fucosa i N-acetil-D-glucosamina. Es tracta d'una sola cadena de 285 aminoàcids que es plega per formar una estructura secundària. A més, conté tres ponts disulfur i està formada per dos subdominis ben diferenciats que es coneixen com L- i R- en referència a la seva posició. El primer (L-) està format majoritàriament per hèlix-α, mentre que el segon (R-) està format per una làmina-β antiparal·lela (que forma el nucli d'aquest subdomini) i dos hèlix-α (situades a la regió superficial en extrems oposats de la làmina-β). Aquesta disposició (L- i R-) possibilita que en la interfase d'aquests subdominis es formi una fenedura en forma de V a la superfície de l'enzim, en la qual els substrats es poden unir (zona activa).
El centre actiu està format per quatre residus: un par iònic de cisteïna (Cys26) i histidina (His158) i com a suport, un d'asparagina (Asn179) i glutamina (Gln20) per ajudar a estabilitzar l'intermediari enzim-substrat que es forma durant la catàlisi. D'aquests, els de cisteïna i histidina es troben en subdominis oposats (L i R respectivament).
Quant a la seva activitat i especificitat, la bromelaïna de la fruita té afinitat per la cadena Bz-Phe-Val-Arg-NHMec, mentre que la de la tija té preferència per substrats que contenen la seqüència Arg-Arg, com la cadena Z-Arg-Arg-NHMec.
Mecanisme d'acció Per a que hi hagi activitat catalítica el grup tiol de l'enzim ha de trobar-se en forma reduïda i per això cal un medi reductor i àcid.
El procés catalític s'inicia amb la unió no covalent de l'enzim lliure i el substrat peptídic, que genera un complex intermediari inestable. Aquest es forma mitjançant l'atac nucleofílic del grup tiol (-SH) de la cisteïna al grup carbonil (C=O) de l'enllaç peptídic del substrat i és estabilitzat pel residu de glutamina (Gln20). Això només és possible si els residus de cisteïna i histidina es troben en forma ionitzada com a ió tiolat (S-) i imidazol (ImH+). A continuació es produeix l'acilació de l'enzim i com a conseqüència es forma i allibera una amina (R’-NH₂). Finalment es produeix una desacilació, en la que el complex acil-enzim reacciona amb una molècula d'aigua per alliberar el grup carboxílic (-COOH) i així regenerar l'enzim lliure. A partir d'aquí es pot iniciar un nou cicle catalític. center|miniatura|911x911px|Esquema del mecanisme d'acció de les cisteïna proteases
Propietats catalítiques S'ha de distingir entre els dos tipus de bromelaïna.
La bromelaïna de la tija té un pes molecular de 24,5 kDa i un punt isoelèctric (pI) de 9,55 pel que es considera una proteïna força bàsica. Presenta activitat enzimàtica en un ampli rang de condicions, té un pH òptim de 6-8,5 però es manté més o menys estable entre pH de 7-10 per a la majoria dels seus substrats i una temperatura òptima d'entre 50 i 60 °C.
La bromelaïna de la fruita té un pes molecular de 25 kDa i un punt isoelèctric (pI) de 4,6 pel que es considera una proteïna relativament àcida. Té un pH òptim de 4,5 però es manté activa entre pH de 3,5-5,5 i una temperatura òptima d'entre 50 i 60 °C. Cal destacar que té encara més activitat proteolítica i una especificitat més àmplia pels enllaços peptídics que la bromelaïna de la tija.
Fonts i mètodes d'obtenció Natural La bromelaïna no està present a les etapes inicials del desenvolupament del fruit i és, a mesura que aquest madura, quan la seva concentració augmenta. De fet, la pinya tropical es caracteritza i diferencia d'altres fruites (ex: la papaia i les figues) en que conté una quantitat relativament elevada de proteases quan és madura.
La producció de bromelaïna de forma industrial comprèn una sèrie de processos diversos: l'extracció, la purificació, l'assecatge i l'envasament.
L'extracció de la proteasa comença amb la obtenció del suc de la pinya a partir de la trituració de les parts seleccionades (part carnosa de la fruita o tija) per mitjà d'una liquadora, d'aquesta manera es facilita el trencament del teixit vegetal i la sortida del líquid o extracte enzimàtic cru que conté la bromelaïna.
La purificació consisteix en la separació de l'enzim que es vol aïllar de qualsevol matèria indesitjable. L'objectiu és retirar impureses i aconseguir l'homogeneïtat de l'extracte. El correcte i eficient desenvolupament d'aquesta fase és clau, ja que afecta el grau de puresa i rendiment que s'obté, l'activitat de l'enzim i influeix en els costos generals del procés.
Habitualment aquesta etapa es realitza per mètodes convencionals però existeixen altres alternatives més modernes.
És útil i un bon procediment de pre-purificació per a concentrar i incrementar la recuperació de bromelaïna tot i que és un procés tediós i que al involucrar varies etapes resulta en rendiments enzimàtics baixos. Consisteix en una centrifugació i ultrafiltració per membranes.
La centrifugació és el procés pel qual s'eliminen compostos sòlids. Afavoreix la disrupció de les cèl·lules vegetals i l'alliberació dels enzims intracel·lulars sense desnaturalització. Posteriorment és necessària una filtració.
La ultrafiltració és un dels millors mètodes per a concentrar proteïnes i permet eliminar altres soluts de menor pes molecular. Tot i així a l'extracte proteic poden quedar restes de pigments, carbohidrats, fibres i lípids, que s'eliminen utilitzant una mescla d'aigua/alcohol. Ara bé, per evitar la desnaturalització de l'enzim i la modificació del seu centre actiu s'ha de minimitzar l'ús de dissolvents orgànics.
Té l'avantatge de que és més eficaç, més econòmic, permet millorar el rendiment enzimàtic, proporciona una major selectivitat i puresa del producte final i implica menys passos. Tanmateix, és car per a la recuperació de producte, presenta problemes d'estabilitat i gran part de les aplicacions comercials de la bromelaïna no requereixen un alt nivell de puresa. Es consideren d'aquest tipus: la filtració en gel, la cromatografia d'intercanvi iònic i la d'afinitat, l'extracció micel·lar inversa i l'extracció aquosa en dues fases.
La filtració en gel es basa en la separació per mida molecular de proteïnes, polisacàrids, àcids nucleics i altres macromolècules. És un tipus de cromatografia que separa les molècules entre una fase mòbil i una fase estacionaria que consta d'una matriu porosa de porositat definida (desitjada).
La cromatografia d'intercanvi iònic també es basa en les propietats àcid-base de les proteïnes. La fase estacionària consisteix en una columna de resina amb anions i cations ja que les proteïnes són amfòteres i sol ser de carboximetilcel·lulosa (CMC) o dietilaminoetil-cel·lulosa (DEAE-cel·lulosa). La CMC com té càrrega negativa, és un intercanviador de cations feble i la DEAE-cel·lulosa al tenir càrrega positiva, n’és un d'anions.
La cromatografia d'afinitat es basa en la separació per interacció química d'alta especificitat entre enzim i substrat. Les cromatografies en general comporten múltiples etapes, tenen una capacitat de mostra petita, la separació és poc eficient i impliquen costos elevats però són altament específiques.
L'extracció aquosa en dues fases es basa en la transferència de massa entre dues fases líquides immiscibles: una mescla de dos polímers incompatibles (polietilenglicol i dextrà) o d'un polímer i una sal, amb una solució rica en aigua. A l'afegir l'enzim a aquestes fases, mostra afinitat per una de les dues fases permetent la seva separació. En la distribució de l'enzim entre aquestes dues fases influeixen la força iònica, el pH, la temperatura, el pes molecular del polímer i el tipus de sal. Un aspecte molt positiu és que com un 70-80 % de les mescles és aigua, redueix la desnaturalització de l'enzim, a més és un mètode econòmic i la separació requereix poc temps.
L'extracció micel·lar inversa produeix la separació de l'enzim d'un dissolvent orgànic en forma de gotes per la presència de tensioactius (micel·les). El que succeeix és que les regions polars (hidròfiles) i no polars (hidròfobes) de la micel·la, indueixen el moviment de la proteïna al seu interior (que sigui solubilitzada). Aquest es veu afectat pel pH, la força iònica de la fase aquosa i la concentració de tensioactius. Té l'avantatge de ser un procés senzill i eficient des del punt de vista energètic, fàcil de traslladar a gran escala i de desenvolupar en continu. Tot i així és difícil recuperar la proteïna del dissolvent que conté restes de tensioactius.
Després de la purificació s'obté una fracció rica en proteasa, que es sotmet a un assecatge mitjançant una liofilització o deshidratació per congelació, en la que és important l'ús de crioprotectors per minimitzar la desnaturalització de l'enzim.
Al final s'obté un extracte en pols groguenc que requereix un envasament amb un material adequat que eviti l'absorció d'humitat.
ADN recombinant Per fer front a l'elevada demanda d'aquest enzim a la indústria, sorgeix una alternativa a la producció per medis naturals: la bromelaïna recombinant.