La proteïna ALDP (adrenoleukodystrophy protein) també coneguda com a ABCD1, és una proteïna peroxisomal que forma part de la família de transportadors ABC (ATP-binding cassette) i pertany a la subfamília ALD.
Aquesta proteïna intervé en el transport o catabolisme peroxisomal dels àcids grassos de cadena molt llarga.
Quan la proteïna ALDP no funciona correctament —per mutacions en el gen ABCD1—, és causant d'una malaltia hereditària greu anomenada adrenoleucodistròfia (ALD).
Història L'any 1993: Mosser, Douar, Sarde, Kioschis, Feil, Moser, Poustka, Mandel i Aubourg van fer servir la clonació posicional per identificar un gen parcialment eliminat en 6 de 85 pacients independents amb ALD. Finalment, es va detectar una deleció idèntica en dos germans que presentaven fenotips clínics diferents d'ALD, és a dir, que en casos familiars, les delecions segregaven amb la malaltia.
Els exons candidats es van identificar mitjançant l'anàlisi informàtica de seqüències genòmiques i es van utilitzar per aïllar ADN complementari mitjançant connexió d'exons i cribratge de biblioteques d'ADN complementari. La seqüència proteica deduïda va mostrar una semblança significativa amb una proteïna de membrana peroxisomal de 70 kDa, implicada en la biogènesi dels peroxisomes i que pertany a la superfamília dels transportadors ATP-binding cassett.
Estructura La proteïna ALDP és un transportador ABC de la subfamília D homodímer; és a dir, que està format per dues còpies idèntiques. Cada monòmer conté dos dominis principals: miniatura|Figura 1. Diagrama de cintes de l'ALDP humà.miniatura|Figura 2. Gràfica de la ABCD1 (treta de la revista Nature). miniatura|Figura 3. Topologia estructural d'una subunitat d'ABCD1 en estat outward-facing, amb anotació de dominis i hèlixs transmembrana. Domini transmembrana (TMD): Sis hèlixs α constitueixen una cavitat per al reconeixement i translocació d'àcids grassos de cadena molt llarga (VLCFA) units a un acil-Coenzim A. Aquestes cavitats transmembrana confereixen la selectivitat necessària per al reconeixement del substrat. Domini d'unió a nucleòtids (NBD): situats al citosol, contenen els motius Walker A i B i el motiu signature LSGGQ, responsables de la hidròlisi d'ATP que impulsa el canvi conformacional. Estudis de cryo-EM han mostrat que ALDP adopta una conformació "inward-facing" en estat apo, amb la cavitat oberta cap al citosol. Quan s'uneix ATP, els NBD es dimeritzen i la proteïna passa a una conformació "outward-facing" per alliberar el substrat al peroxisoma. Aquest cicle és fonamental per a la β-oxidació peroxisomal. En el dímer transportador, dos dominis transmembrana formen el camí de translocació del substrat, i dos dominis d'unió a nucleòtids formen el lloc d'unió a l'ATP, que s'encarrega de la unió i hidròlisi d'aquest nucleòtid.
Activitat ATPasa de l'ALDP L'ALDP presenta activitat ATPasa dependent de substrat, característica de les proteïnes ABC. Assajos bioquímics han demostrat que la presència d'àcids grassos de cadena molt llarga (VLFCA) conjugats amb CoA, com el C22:O-Coa, estimula significativament la hidròlisi d'ATP.
En condicions experimentals, l'activitat ATPasa augmenta amb la concentració d'ATP de manera sigmoïdal, suggerint cooperativitat positiva entre els dominis d'unió a nucleòtids (NBD). Això indica que la unió d'una molècula d'ATP facilita la unió de les següents, coherent amb un mecanisme de dimerització funcional dels NBD.
D'altra banda, l'activitat també depèn del tipus de substrat lipídic. Aquest comportament es reflecteix en el gràfic de la (Figura 2) amb dos panells, l'ALDP mostra una cinètica clara davant VLFCA-CoA com C22:O, C24:O, C26:O, mentre que substrats curts com l'acetil-CoA no generen activitat detectable. Això confirma especificitat de substrat per cadenes llargues, coherent amb la seva funció en el transport peroxisomal.
Panell a: L'activitat ATPasa augmenta amb la concentració d'ATP en presència de C22:O-CoA, mentre que els controls no mostren activitat. La corba és hiperbòlica, compatible amb una cinètica de Michaelis-Menten, indicant un mecanisme no cooperatiu en la unió d'ATP.
Panell b: L'activitat ATPasa s'incrementa amb la concentració de VLFCA-CoA, però no amb acetil-CoA. Algunes corbes mostren una forma sigmoidal, suggerint cooperativitat positiva en la unió del substrat lipídic, d'acord amb un model de Hill amb coeficient n>1.
Topologia La topologia d'una subunitat de l'ABCD1 es mostra en la figura 3. Cada monòmer conté sis hèlixs transmembrana (TM1-TM6) que travessen la membrana peroxisomal, així com un domini citosòlic d'unió a nucleòtids (NBD), responsable de la hidròlisi d'ATP.
A la representació esquemàtica d'una subunitat en estat outward-facing, es poden identificar diversos elements estructurals:
N i C: els extrems N-terminal i C-terminal, tots dos orientats cap al citosol. TM1-TM6: hèlixs transmembrana que formen el canal de translocació del substrat. IH2 (Internal Helix 2): hèlix interna situada entre segments transmembrana, implicada en l'estabilització del domini transmembrana. Elbow: regio de flexió entre hèlixs que confereix flexibilitat estructural i facilita els canvis conformacionals durant el cicle de transport. NBD (Nucleotide Binding Domain): domini citosòlic que uneix i hidrolitza ATP, proporcionant l'energia necèssaria per a la translocació dels substrats com els acils-CoA de cadena molt llarga.
És una organització modular que permet la coordinació entre el reconeixement del substrat, l'activació per ATP i el canvi conformacional que impulsa el trasport a través de la membrana peroxisomal.
Funció La funció principal de la proteïna ALDP és el transport peroxisomal d'àcids grassos de cadena molt llarga (very long-chain fatty acids, VLCFAs) des del citosol fins al lumen dels peroxisomes per la seva degradació mitjançant la β-oxidació.
Respecte a l'activitat transportadora dependent d'ATP, també té una activitat tioesterasa d'acil-Coenzim A d'àcids grassos (ACOT). De manera que hidrolitza els VLCFA-coA en VLCFA abans del seu transport dependent d'ATP cap als peroxisomes, sent aquesta activitat ACOT essencial durant aquest procés de transport.
A més a més, està involucrada en diversos processos: controla la fase activa de la mielinització en regular negativament l'activitat de l'elongació microsomal d'àcids grassos, i també pot jugar un paper crucial en el manteniment de l'axó i la mielina. Amb tot això, intervé en la resposta cel·lular a l'estrès oxidatiu en regular funcions mitocondrials com la fosforilació oxidativa i la despolarització mitocondrial. En darrera instància, modula la resposta inflamatòria en regular la β-oxidació peroxisomal dels VLCFA.
Per tant, l'ALDP participa tant en la regulació dels VLCFA com del metabolisme energètic, concretament en la degradació i biosíntesi d'àcids grassos.
Mecanisme de reconeixement i translocació dels VLCFA miniatura|Figura 4. Il·lustració del cicle de transport de la proteïna ALDP. Les quatre estructures de la proteïna ALDP orientades cap a l'interior presenten un canal obert al citosol amb mides variables. El substrat hexacosanoil-CoA (C26:0-CoA) s'uneix als dominis transmembrana (TMDs) i estimula l'activitat ATPasa dels dominis d'unió a nucleòtids (NBDs). El residu W339 de l'hèlix transmembrana 5 (TM5) és essencial per a la unió del substrat i per a l'estimulació de la hidròlisi d'ATP induïda pel substrat. L'ABCD1 un domini únic de bobina enrotllada (coiled-coil) al terminal C que modula negativament l'activitat dels NBDs. A més, l'estructura de la proteïna en l'estat orientat cap a l'exterior indica que les molècules d'ATP apropen els dos NBDs i obren els TMDs cap al lumen del peroxisoma per alliberar el substrat.
Procés de β-oxidació peroxisomal i obtenció del LCFA-CoA miniatura|252x252px|Figura 5. El procés de β-oxidació peroxisomal. Els VLCFAs requereixen una oxidació prèvia al peroxisoma abans de poder patir la β-oxidació als mitocondris. Aquest procés rep el nom de β-oxidació peroxisomal (Figura 5). Tot i que les seves reaccions són molt similars a les de la β-oxidació dels mitocondris, aquestes utilitzen diferents enzims catalítics, diferent cadena de transport d’electrons, i diferent orientació dels metabòlits.
La ALDP transporta els VLCFAs des del citosol cap a l’interior del peroxisoma i aquests són activats per l’enzim VLCFA-CoA sintetasa, que afegeix un grup CoA gastant ATP, formant VLCFA-CoA (un acyl-CoA). Aquest patirà diferents oxidacions fins a arribar a Fatty acyl-CoA + Acetil-CoA.
L'enzim Acyl-CoA Oxidase 1 (ACOX1) deshidrogena el VLCFA-CoA, i dona com a producte un Enoyl-CoA. En aquesta recció també tindrà lloc la reducció d’un FAD a FADH2, de manera que aquest serveixi per reduir un O2 a H2O2 (a través de la seva oxidació a FAD). El producte d’aquesta reacció patirà una hidròlisi per l’enzim D-bifunctional protein (D-BP), que donarà com a producte un 3-hydroxyacyl-CoA. Es donarà una segona deshidrogenació per l’enzim D-bifunctional protein (D-BP) que donarà com a producte un 3-ketoacyl-CoA. A més, en aquesta reacció també es produirà la reducció d'un NAD+ a NADH+H+. Finalment, es dona una tiòlisi del 3-ketoacyl-CoA que pot ser catalitzada per 2 isoenzims, la CoA Acyltransferase 1 (ACAA1) i el Sterol carrier protin-x (SCP-X). Un d'aquests enzims catalitzarà el trencament de la molècula en un Fatty acyl-CoA i un Acetil-CoA (2 carbonis).
Aquest procés es repetirà tantes vegades com calgui fins que el nombre de carbonis de la cadena sigui inferior a 18 fins a un mínim de 8 carbonis, un nombre que varia en funció del tipus de teixit. Això implica que es poden obtenir cadenes d’àcids grassos amb un rang d'entre 16 i 8 carbonis, tot i que també es poden obtenir altres longituds més petites en menys freqüència.miniatura|Figura 6. Síntesi d'àcids grassos de cadena molt llarga (VLCFA) al llum dels peroxisomes mitjançant β-oxidació.
Com que la membrana peroxisomal és impermeable als èsters de CoA, el Fatty acyl-CoA no pot sortir directament del peroxisoma, per tant, haurà de patir una modificació per poder fer-ho. El Fatty acyl-CoA pot patir una conversió en Fatty acyl-Carnitina o ser alliberat com a àcid gras lliure per poder sortir del peroxisoma.
Per ser transformat en Fatty acyl-carnitina, l'enzim carnitina acetiltransferasa peroxisomal transfereix el grup acil (R–CO-) des del CoA a la carnitina, formant un CoA lliure + Fatty acyl-carnitina. Per obtenir un àcid gras lliure, una tiolasa o acil-CoA hidrolasa allibera el Fatty acyl-CoA com a àcid gras lliure (R-COOH). Aquests dos productes si que podràn travessar la membrana peroxisomal cap al citosol per després ser introduïts al mitocondri.
Si el producte entra com a àcid gras lliure aquest és activat per l’enzim acil-CoA sintetasa consumint ATP, transformant-lo en LCFA-CoA. Si entra com a Fatty acyl-carnitina l'enzim carnitina acetiltransferasa mitocondrial el tornarà a transformar de nou en LCFA-CoA consumint ATP. Un cop obtenim el LCFA-CoA ja es pot iniciar la β-oxidació mitocondrial.
Un cop l’acyl-CoA ha estat activat, les reaccions del cicle de la β-oxidació tant peroxisomal com mitocondrial no consumeixen ATP pel fet que aquestes són energèticament favorables, per tant, només consumeix ATP en l’activació de l’acyl-CoA en les entrades del VLCFA al peroxisoma i de l’àcid gras lliure (R-COOH) o Fatty acyl-carnitina al mitocondri.
Localització cel·lular La proteïna ALDP es troba a la membrana dels peroxisomes cel·lulars, on forma part del sistema transportador de membrana. S'ha vist que ALDP interactua amb la proteïna peroxina PEX19p, involucrada en la biogènesi peroxisomal. La interacció succeeix en una regió N-terminal interna de l'ALDP, que és important per a una correcta orientació peroxisòmica d'aquesta proteïna.
Família de transportadors ABC (ATP-binding cassette)