miniatura|Exemple de cocultiu NAM 2D de cèl·lules epitelioides i macròfags. Les metodologies de nova aproximació (MNAs) són protocols, tecnologies i línies d'actuació de prova substitutives que estan en consonància amb les directrius (Substitució, Reducció i Refinament) per a l'ús ètic de models animals. Tant la Food and Drug Administration (FDA) com l'Agència Europea de Medicaments (EMA), els dos principals organismes en la normativa farmacèutica mundial, han definit entorns de treball per afavorir la validació i la possible incorporació d'aquestes MNA en els procediments reguladors.

Les MNA comprenen assaigs bàsics basats en cèl·lules 2D, sistemes avançats in vitro derivats d'humans 3D com ara organoides o òrgans en un xip, models computacionals predictius in silico com ara QSAR i òmica com ara tecnologies transcriptòmiques, entre altres metodologies. A través de l'ús d'aquests patrons biològics procedents d'humans, les MNA estan concebudes per anticipar efectes de salut humana, disminuir les despeses operatives i agilitzar els terminis de creació de fàrmacs.

Història El fonament teòric de les alternatives actuals a l'experimentació amb animals va ser formulat el 1959 pel zoòleg britànic William MS Russell i el microbiòleg Rex L. Burch a la seva obra The Principles of Humane Experimental Technique, on van proposar l'enfocament de les "3R":

Substitució: Utilitzar models o sistemes no animals sempre que sigui possible per assolir la mateixa finalitat científica. Reducció: L'objectiu és reduir al mínim el nombre d'animals utilitzats sense perjudicar el rigor científic. Refinament: Optimització dels protocols experimentals per mitigar el dolor, el malestar o l'angoixa eventuals per als animals objecte d'estudi.

Durant finals del segle XX i principis del XXI, els ràpids avenços en biologia molecular, informàtica i enginyeria biològica van obrir noves línies de treball per a la recerca científica que no precisaven models animals. El 2007, el Consell Nacional de Recerca (NRC) va difondre un informe transcendental titulat Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy. L'informe advocava per una transformació dels models convencionals basats en animals cap a l'anàlisi de "vies de toxicitat" cel·lulars i moleculars a través de cèl·lules humanes i models informàtics.

L'acrònim específic "MNA" inicialment significava "Metodologies de nova aproximació" i es va popularitzar àmpliament dins de la ciència reguladora. Un dels primers exemples d'ús d'aquest concepte va ser durant un taller organitzat per l'Agència Europea de Substàncies Químiques el 2016 a Hèlsinki, titulat New Approach Methodologies in Regulatory Science, consolidant el terme MNAs dins dels àmbits normatius. També se sap que algunes institucions de recerca dins de l'àrea de coneixement van estendre el significat de la sigla per designar "Models no animals" o "Nous mètodes alternatius" per descriure la seva progressiva implementació en la recerca biomèdica general. A més, un conjunt de noves revisions reguladores i avenços tècnics han incorporat de manera sòlida les MNAs en els eixos principals de desenvolupament de fàrmacs.

Tecnologies bàsiques de les MNA Hi ha diverses tecnologies accessibles que s'emmarquen en les MNA, principalment tecnologies punteres no animals, metodologies i estratègies de prova utilitzades en l'àmbit de la recerca biomèdica . Aquestes tecnologies engloben models in vitro, in silico i models computacionals i emergents instruments d'alt procesament com ara les tecnologies òmiques.

Assajos basats en cèl·lules 2D Els assajos basats en cèl·lules 2D són tècniques de cultiu cel·lular 2D que empren cèl·lules vives que proliferen en una monocapa plana i única de cèl·lules ancorades a una superfície sòlida de plàstic, com ara flascons de cultiu cel·lular o plaques de múltiples pous amb 6, 24, 48, 96 o fins i tot més pous independents. Les cèl·lules es distribueixen horitzontalment per la base d'una superfície ferma determinada i estan en contacte directament amb el seu medi de cultiu cel·lular idoni. Un cop les cèl·lules s'adhereixen, proliferen i secreten compostos al medi que es poden examinar i mesurar.

Històricament, els assaigs basats en cèl·lules 2D han estat la font principal de les MNAs per la seva compatibilitat d'alt rendiment, la seva fàcil estandardització i reproductibilitat i la seva eficiència en termes de costos. A continuació es mostren alguns exemples de diferents lectures que es poden realitzar amb cultius cel·lulars 2D:

Viabilitat cel·lular i citotoxicitat - Vius/Morts: aquesta anàlisi examina l'estat fisiològic basal d'una població cel·lular mesurant l'activitat metabòlica o la integritat de la membrana cel·lular per determinar si una substància és intrínsecament letal per a les cèl·lules humanes. Nivell de proteïnes - ELISA : aquest procediment utilitza interaccions selectives d'anticossos-antigen per determinar amb exactitud la concentració de proteïnes, enzims o citocines inflamatòries d'interès segregades per les cèl·lules en reacció davant del tractament químic. Imatges d'alt contingut - Immunofluorescència : aquesta metodologia de microscòpia utilitza anticossos conjugats amb fluorescència per observar i monitorar les alteracions espacials, estructurals i fenotípiques dins de les cèl·lules fixes. Cribratge d'alt rendiment - qPCR : aquest mètode utilitza colorants fluorescents per mesurar la concentració d'ADN en temps real mentre té lloc l'amplificació.

Plataformes avançades 3D in vitro A diferència de les tècniques clàssiques de cultiu cel·lular en 2D, aquests sistemes d'última generació de cultiu cel·lular en 3D faciliten que les cèl·lules proliferen, es desplacin e interactuïn de manera tridimensional reproduint el microentorn in vivo, inclosa matriu extracel·lular . Aquests dispositius redueixen la distància translacional entre els cultius cel·lulars en 2D estàndard i la fisiologia complexa dels teixits natius.

Organoides Els organoides són estructures cel·lulars 3D in vitro derivades de cèl·lules mare o cèl·lules progenitores específiques d'òrgan que repliquen l'arquitectura espacial i les característiques funcionals dels òrgans in vivo mitjançant un procés d'autoorganització. La rellevància fisiològica dels organoides es deu a la seva arquitectura cel·lular 3D, el seu potencial d'expansió a llarg termini i la seva aplicabilitat en un ampli espectre de tipus de teixits. miniatura|350x350px|Organoide cerebral observat sota un microscopi de fluorescència. Alguns dels principals desenvolupaments històrics i la generació reeixida dels principals tipus de teixits organoides s'enumeren a continuació:

Escorça cerebral: organoides cerebrals humans complexos i multicapa. Intestí: recapitulació del microambient i l'arquitectura intestinals. Fetge: brots hepàtics vascularitzats i funcionals. Pulmó: organoides de cèl·lules mare broncoalveolars. Retina: copa òptica estratificada autoorganitzada i teixit retinal. Estómac: organoides gàstrics derivats de cèl·lules mare primàries.

Les tecnologies organoides estan subjectes a limitacions tècniques i estructurals específiques. La naturalesa espontània del procés d'autoorganització pot introduir variabilitat en la uniformitat geomètrica, les dimensions estructurals i la replicació morfològica dels òrgans diana.

Òrgan en un xip Els òrgans en un xip (OoC) són dispositius microfluídics fets de materials altament biocompatibles, com el polidimetilsiloxà (PDMS), per aconseguir microentorns 3D beneficiosos per a les cèl·lules. Aquesta configuració espacial facilita interaccions complexes de senyalització cèl·lula a cèl·lula que normalment són absents en els cultius 2D convencionals, augmentant així la fidelitat de les simulacions a nivell d'òrgan. En combinar estructures 3D localitzades amb forces fisiològiques dinàmiques i microentorns controlats, aquests models microfluídics permeten la replicació de respostes d'interfície teixit-teixit crítiques per a la fisiologia dels òrgans humans. miniatura|Exemple d'òrgan en un xip fet de PDMS. Una de les esencials diferències dels OoC en comparació amb els organoides és la facultat de replicar estímuls mecànics específics en els microteixits. Forces com la tensió de fricció del fluid, que simulen el flux sanguini a través del medi de cultiu cel·lular, o pressions mecàniques com la compressió o l'estirament, que simulen les forces mecàniques dins del teixit del miocardi, reproduint el batec del cor, la respiració, el moviment i altres fenòmens fisiològics.

Aquestes plataformes poden estar interconnectades fluidament per enllaçar múltiples compartiments específics de teixits o òrgans. Aquests dispositius poden gestionar cocultius de múltiples tipus de cèl·lules dins de microentorns localitzats. Aquesta integració permet el desenvolupament de models multicel·lulars complexos que preserven alts graus de rellevància fisiològica per a la recerca biomèdica i toxicològica.

Modelització computacional in silico La modelització in silico dins de les MNAs utilitza eines de bioinformàtica, biologia de sistemes i altres sistemes per construir simulacions computades de processos cel·lulars, subcel·lulars i a nivell d'òrgan. Aquest enfocament es basa en dades biològiques riques en informació i d'alt rendiment per descriure matemàticament les interaccions entre tots els components moleculars dins d'un sistema biològic.

QSAR Els models quantitatius de relació estructura-activitat (QSAR) són eines matemàtiques computacionals que prediuen l'activitat biològica, la toxicitat o les propietats fisicoquímiques de compostos químics no provats basant-se en les seves estructures moleculars. La premissa fonamental de QSAR és que els efectes biològics d'una substància química són una funció directa de les seves característiques estructurals i tradueixen la química molecular directament en resultats biològics predictius in silico.

Tecnologia òmica Les tecnologies òmiques engloben un conjunt de mètodes de biologia molecular d'alt rendiment que s'utilitzen per detectar, cartografiar i analitzar els perfils biològics complets de cèl·lules, teixits o organismes . En lloc de centrar-se en variables aïllades úniques, les tècniques òmiques capturen capes de dades globals i sistèmiques. Les tecnologies òmiques ara impulsen la medicina de precisió a través del descobriment de biomarcadors, el diagnòstic, el pronòstic i la personalització del tractament.

Genòmica Aquest va ser el primer camp de l'òmica que es va desenvolupar i consisteix en l'estudi exhaustiu de la seqüència completa d'ADN d'un organisme. En les avaluacions de seguretat, el mapatge genòmic identifica seqüències genètiques basals, variacions hereditàries i possibles anomalies estructurals o mutacions induïdes per factors d'estrès químic extern.

Les tecnologies clau per a la genòmica són les plataformes de seqüenciació de nova generació (NGS), que s'utilitzen àmpliament per descodificar genomes complets. La seqüenciació Sanger d'alt rendiment s'utilitza per a la validació de gens dirigits, mentre que els microarrays d'ADN s'utilitzen per detectar polimorfismes de nucleòtid únic (SNP) en grans cohorts de mostres.

Transcriptòmica L'anàlisi a gran escala de tots els transcrits d'ARN produïts per una població cel·lular en un moment específic. Aquesta disciplina rastreja els canvis dinàmics i immediats en l'expressió i la regulació gènica després de l'exposició a un compost xenobiòtic, destacant quines vies cel·lulars s'activen o suprimeixen. miniatura|Tecnologies òmiques associades a processos biològics. Les tecnologies transcriptòmiques modernes es basen en plataformes d'alt rendiment com la seqüenciació d'ARN (RNA-Seq) i els microarrays d'alta densitat. Aquests processos experimentals processen milions de fragments d'ARN simultàniament, traduint reaccions cel·lulars biològiques complexes en conjunts de dades digitals estandarditzats que alimenten directament models de seguretat in silico.

Proteòmica