Espectroscòpia de ressonància magnètica nuclear d'hidrats de carboni (RMN d'hidrats de carboni) és l'aplicació de l'espectroscòpia de ressonància magnètica nuclear (RMN) a l'anàlisi estructural i conformacional dels carbohidrats. Aquest mètode permet als científics elucidar l'estructura de monosacàrids, oligosacàrids, polisacàrids, glicoconjugats i altres derivats d'hidrats de carboni de fonts sintètiques i naturals. Entre les propietats estructurals que es poden determinar per RMN hi ha l'estructura primària (inclosa l'estereoquímica), la conformació dels sacàrids, l'estequiometria dels substituents i la proporció de sacàrids individuals en una mescla. Instruments moderns de RMN d'alt camp utilitzats per a mostres de carbohidrats, normalment 500 MHz o superior, són capaços d'executar un conjunt d'experiments 1D, 2D i 3D per determinar l'estructura de compostos d'hidrats de carboni.
Observables de RMN d'hidrats de carboni Desplaçament químic Els rangs de desplaçament químic comuns per als nuclis dins dels residus de carbohidrats són:
Els desplaçaments químics típics de la RMN d'1H dels protons de l'anell de carbohidrats són de 3 a 6 ppm (4,5 a 5,5 ppm per a protons anomèrics). Els desplaçaments químics típics de la RMN del 13C dels carbonis de l'anell dels carbohidrats són de 60–110 ppm
En el cas de molècules simples de mono i oligosacàrids, tots els senyals de protons solen estar separats entre si (normalment a 500 MHz o instruments de RMN millors) i es poden assignar només utilitzant l'espectre de RMN 1D. No obstant això, les molècules més grans presenten una superposició significativa del senyal de protons, especialment a la regió no anomèrica (3-4 ppm). La RMN de carboni-13 supera aquest desavantatge mitjançant una gamma més àmplia de desplaçaments químics i tècniques especials que permeten bloquejar l'acoblament d'espín carboni-protó, fent que tots els senyals de carboni, tant alts com estrets, siguin distingibles entre si.
Els rangs típics de canvis químics de carboni específics dels carbohidrats en els monosacàrids no substituïts són:
Carbonis anomèrics: 90-100 ppm Carbonis de l'anell de sucre amb funció hidroxi: 68-77 Carbonis de sucre en forma oberta amb funció hidroxi: 71-75 Carbonis de l'anell de sucre amb una funció amino: 50-56 Grups hidroximetil exocíclics: 60-64 Grups carboxi exocíclics: 172-176 Carbonis de l'anell de sucre desoxigenat: 31-40 Un carboni al tancament de l'anell de piranosa: 71-73 (α-anòmers), 74-76 (β-anòmers) Un carboni al tancament de l'anell de furanosa: 80-83 (α-anòmers), 83-86 (β-anòmers)
Constants d'acoblament Les constants d'acoblament directe carboni-protó s'utilitzen per estudiar la configuració anomèrica d'un sucre. Les constants d'acoblament protó-protó vicinals s'utilitzen per estudiar l'orientació estereoscòpica dels protons respecte als altres protons dins d'un anell de sucre, identificant així un monosacàrid. Les constants d'acoblament heteronuclears vicinals d'HCOC s'utilitzen per estudiar angles de torsió al llarg de l'enllaç glicosídic entre sucres o al llarg de fragments exocíclics, revelant així una conformació molecular.
Els anells de sucre són fragments moleculars relativament rígids, per la qual cosa els acoblaments protó-protó vicinals són característics:
Equatorial a axial: 1–4 Hz Equatorial a equatorial: 0–2 Hz Axial a axial no anomèric: 9–11 Hz Anomèric axial a axial: 7–9 Hz Hidroximetil axial a exocíclic: 5 Hz, 2 Hz Geminal entre protons hidroximetil: 12 Hz
Efectes nuclears de Overhauser (NOE) Els NOE són sensibles a les distàncies interatòmiques, cosa que permet el seu ús com a sonda conformacional o com a prova de la formació d'un enllaç glucòsid. És una pràctica habitual comparar els NOE protó-protó calculats amb els experimentals en oligosacàrids per confirmar un mapa conformacional teòric. El càlcul dels NOE implica una optimització de la geometria molecular.
Altres observables de RMN Es va informar que les relaxivitats, les taxes de relaxació nuclear, la forma de les línies i altres paràmetres eren útils en estudis estructurals dels carbohidrats.
Elucidació de l'estructura dels carbohidrats mitjançant espectroscòpia de RMN Paràmetres estructurals dels carbohidrats
La següent és una llista de característiques estructurals que es poden elucidar mitjançant RMN:
Estructura química de cada residu de carbohidrat en una molècula, incloent-hi mida de l'esquelet de carboni i tipus de sucre (aldosa/cetosa) mida del cicle (piranosa/furanosa/lineal) configuració estereo de tots els carbonis (identificació de monosacàrids) configuració estereo del carboni anomèric (α/β) configuració absoluta (D/L) localització de les funcions amino, carboxi, desoxi i altres Estructura química dels residus no carbohidrats de la molècula (aminoàcids, àcids grassos, alcohols, aglicons orgànics, etc.) Posicions de substitució en residus Seqüència de residus Estequiometria dels residus terminals i les cadenes laterals Ubicació dels enllaços dièster de fosfat i sulfat Grau de polimerització i posicionament del marc (per a polisacàrids)
Espectroscòpia de RMN vs. altres mètodes Els mètodes àmpliament coneguts d'investigació estructural, com ara l'espectrometria de masses i l'anàlisi de raigs X, només són aplicables de manera limitada als carbohidrats. Aquests estudis estructurals, com la determinació de seqüències o la identificació de nous monosacàrids, són els que més es beneficien de l'espectroscòpia de RMN. La configuració absoluta i el grau de polimerització no sempre es poden determinar només mitjançant RMN, per la qual cosa el procés d'elucidació estructural pot requerir mètodes addicionals. Tot i que la composició monomèrica es pot resoldre mitjançant RMN, els mètodes cromatogràfics i d'espectroscòpia de masses proporcionen aquesta informació de vegades més fàcilment. Les altres característiques estructurals enumerades anteriorment es poden determinar únicament mitjançant mètodes espectroscòpics de RMN. La limitació dels estudis estructurals de RMN dels carbohidrats és que l'elucidació de l'estructura difícilment es pot automatitzar i requereix un expert humà per derivar una estructura a partir dels espectres de RMN.
Aplicació de diverses tècniques de RMN a carbohidrats Els glicans complexos posseeixen una multitud de senyals superposats, especialment en un espectre de protons. Per tant, és avantatjós utilitzar experiments 2D per a l'assignació de senyals. La taula i les figures següents enumeren les tècniques de RMN més esteses utilitzades en estudis d'hidrats de carboni. esquerra|miniatura|Tècniques de RMN heteronuclear en estudis de carbohidrats, i àtoms típics intra-residus (vermell) i inter-residus (blau) que s'uneixen entre si. cap|miniatura|Tècniques de RMN homonuclear en estudis de carbohidrats, i àtoms típics intra-residus (vermell) i inter-residus (blau) que s'uneixen entre si.
Esquema de recerca La investigació espectroscòpica per RMN inclou els passos següents:
Extracció de material carbohidrat (per a glicans naturals) Eliminació química de grups que emmascaren la regularitat (per a polímers) Separació i purificació de material d'hidrats de carboni (per a experiments de RMN 2D, 10 mg o més (es recomana) Preparació de la mostra (normalment en D2O) Adquisició d'espectres 1D Planificació, adquisició i processament d'altres experiments de RMN (normalment requereix de 5 a 20 hores) Assignació i interpretació d'espectres (vegeu la figura exemplar) Si no es pot resoldre un problema estructural: modificació/degradació química i anàlisi RMN dels productes Adquisició d'espectres del compost natiu (sense emmascarar) i la seva interpretació basada en l'estructura modificada Presentació de resultats
cap|marc|Esquema aproximat de les tècniques de RMN (blau) i altres (verd) aplicades a l'elucidació de l'estructura dels carbohidrats, i informació obtinguda (en requadres)
Bases de dades i eines de RMN de carbohidrats S'han creat múltiples bases de dades de desplaçament químic i serveis relacionats per ajudar a l'elucidació estructural i l'anàlisi experta dels seus espectres de RMN. D'elles, diverses eines informàtiques estan dedicades exclusivament als carbohidrats:
GlycoSCIENCES.de més de 4.000 espectres de RMN de glicans de mamífers cerca d'estructura mitjançant senyals de RMN i viceversa La CSDB (base de dades d'estructura d'hidrats de carboni) conté: més de 20.000 espectres de RMN (a partir del 2024) de glicans bacterians, vegetals, fúngics i protistales, cerca d'estructura mitjançant senyals de RMN i viceversa rutina de simulació d'espectres empírics optimitzada per a carbohidrats, estimació estadística del desplaçament químic basada en l'algoritme HOSE optimitzat per a carbohidrats, generació d'estructures i eina de classificació basada en RMN. CASPER (avaluació de l'espectre assistit per ordinador de polisacàrids regulars), conté: base de dades de desplaçament químic, rutina de simulació d'espectres empírics optimitzada per a carbohidrats, interfície en línia. eina de coincidència d'estructures. Tant els desplaçaments químics de C i H de protons com de carboni es poden utilitzar per accedir a informació estructural.
Simulació dels observables de RMN miniatura|Predicció comparativa de l'espectre de RMN 13C de la sacarosa utilitzant diversos mètodes. L'espectre experimental es troba al mig. L'espectre superior (negre) es va obtenir mitjançant rutina empírica. Els espectres inferiors (vermell i verd) es van obtenir mitjançant càlculs químicoquàntics en PRIRODA i GAUSSIAN respectivament. Informació inclosa: nivell de teoria/conjunt base/model de dissolvent utilitzat, precisió de la predicció (factor de correlació lineal i desviació quadràtica mitjana), temps de càlcul a l'ordinador personal (blau). S'han revisat diversos mètodes per simular els observables de RMN dels carbohidrats. Inclouen:
Mètodes universals de bases de dades estadístiques (ACDLabs, Modgraph, etc.) Ús de xarxes neuronals per refinar les prediccions Mètodes basats en la regressió CHARGE Esquemes empírics optimitzats en carbohidrats (CSDB/BIOPSEL, CASPER). Càlcul combinat de mecànica molecular/geometria dinàmica i simulació/iteració mecànica quàntica d'observables de RMN (programari PERCH NMR) Enfocaments ONIOM (optimització de diferents parts de la molècula amb diferent precisió) Càlculs ab initio.
La creixent potència computacional permet l'ús de càlculs mecànics quàntics exhaustius a alts nivells de teoria i grans conjunts de bases per refinar la geometria molecular dels carbohidrats i la posterior predicció d'observables de RMN mitjançant GIAO i altres mètodes amb o sense compte de l'efecte del dissolvent. Entre les combinacions de nivell de teoria i un conjunt de bases que es van considerar suficients per a les prediccions de RMN hi havia B3LYP/6-311G++(2d,2p) i PBE/PBE (vegeu la revisió). Es va demostrar que, per als sacàrids, els esquemes empírics optimitzats per carbohidrats proporcionen una precisió significativament millor (0,0-0,5 ppm per ressonància de 13C) que els mètodes químics quàntics (per sobre de 2,0 ppm per ressonància) que s'han reportat com a millors per a simulacions de RMN, i funcionen milers de vegades més ràpid. Tanmateix, aquests mètodes només poden predir canvis químics i tenen un rendiment deficient per a les parts no carbohidrats de les molècules. Com a exemple representatiu, vegeu la figura de la dreta.
Referències
Categoria:Ressonància magnètica nuclear Categoria:Carbohidrats