náhled|Peroxidáza je enzym, tzn. patří mezi proteiny; zde znázorněna glutathion peroxidáza Avidin-peroxidáza (též avidin-peroxidasa) je modifikovaná peroxidáza (nejčastěji získávaná z křenu selského, Armoracia rusticana), na kterou je kovalentně připojen protein avidin (z vaječného bílku).
Použití náhled|Mikrofotografie lidských HeLa buněk; tmavé skvrny znázorňují místa, kde se vyskytuje v buňce protein transferin, a to právě pomocí vazby křenové peroxidázy na bílkovinu transferin Avidin-peroxidáza se velmi často používá v laboratoři k vizualizaci různých biochemických interakcí (protein-proteinových, protein-sacharidových…), u nichž jeden z účastníků této interakce je modifikován biotinem. Avidin je schopen se specificky a velmi silně vázat na biotin a přes tzv. avidin-biotinový můstek je tedy schopen připojit peroxidasu k interagujícím látkám.
Peroxidáza pak po dodání zdroje peroxidu (H2O2, NaBO3…) a vhodného substrátu (jenž oxiduje a změní jeho vlastnosti –barva, rozpustnost) vizualizuje tuto interakci. Příkladem vhodných substrátů mohou být 4-chloro-1-naftol – po oxidaci dochází ke vzniku nerozpustné fialové látky – a ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonát), který tvoří stabilní, zeleně zbarvené rozpustné radikály. náhled|vzorec ABTS
Avidin peroxidasy se často využívá při metodě ELISA a ELBA metodě a při western blotu. Podobně jako avidin-peroxidasa se však také často využívá kyselá nebo alkalická avidin-fosfatáza.
Stavební částice
Křenová peroxidáza
křenová peroxidáza alternativní názvy HRP, horseradish peroxidase zdrojkřen selský (Armoracia rusticana) molekulová hmotnost~44 000Welinder, K.G., Eur. J. Biochem., 96, 483–502 (1978) počet isoenzymů 7Shannon, L.M., et al., J. Biol. Chem., 241, 2166–2172 (1966). pI 3-9 pH optimum6-6,5Schomberg, D., Salzmann, M., and Stephan, D., Enzyme Handbook 7, EC 1.11.1.7:1–6 (1993).inhibitoryCN−, S2−, F−, N3−, Fe3+,Zollner, H., Handbo]ok of Enzyme Inhibitors, 2nd Ed., Part A: 367–368 (1993).
Avidin náhled|biotin
avidin zdroj vaječný bílek molekulová hmotnost homotetramer, celková Mr = 66-69 000 pI 10,5 biologická funkce antimikrobiální agents, vyvazuje biotin nutný pro růst bakterii (KD(avidin-biotin) = 1,10-15M) Podobně jako avidin se používá i streptavidin – protein o podobných vlastnostech jako avidin (silná a specifická vazba biotinu) izolovaný z Streptomyces avidinii. Na rozdíl od avidinu není streptavidin vůbec glykosylován.
Používané substráty avidin peroxidázy zkratkanázevrozpustnost produktuDAB3,3'diaminobezidinN4-CN4-chloro-1-naftolNHYRHanker-Yaks reagentNAEC3-amino-9-ethylethanolNTMB3,3',5,5'-tetrametylbenzidinNOPDo-fenylendiaminRABTS2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonátR
Příprava avidin-peroxidázy Křenová peroxidáza je kovalentně připojena na avidin pomocí bismaleimidu (dimaleimidu) v poměru přibližně 2:1 (HRP:avidin)O'Sullivan MJ, et al, FEBS letters, 35, 311-313 (1978).
Odkazy
Reference
Související články ELISA avidin peroxidázy mikrotitrační destička
Kategorie:Oxidoreduktázy