L'expression hétérologue désigne l'expression d'un gène ou d'une partie d'un gène dans un organisme hôte qui ne possède pas naturellement le gène ou le fragment de gène en question. L'insertion du gène dans l'hôte hétérologue est réalisée par la technologie de l'ADN recombinant. L'expression hétérologue a souvent pour but de déterminer les effets des mutations et des interactions différentielles sur la fonction des protéines. Elle permet d'exprimer efficacement et d'expérimenter des combinaisons de gènes et de mutants qui n'existent pas à l'état naturel.

Selon la durée de la recombinaison dans le génome de l'hôte, il existe deux types d'expression hétérologue : à long terme (stable) et à court terme (transitoire). L'expression à long terme est une intégration potentiellement permanente dans le gène et l'expression à court terme est une modification temporaire qui dure de 1 à 3 jours.

Après avoir été inséré dans l'hôte, le gène peut être intégré dans l'ADN de l'hôte, provoquant une expression permanente, ou non intégré, provoquant une expression transitoire. L'expression hétérologue peut se faire dans de nombreux types d'organismes hôtes. L'organisme hôte peut être une bactérie, une levure, une cellule de mammifère ou une cellule végétale. Cet hôte est appelé « système d'expression ». L'expression homologue, quant à elle, fait référence à la surexpression d'un gène dans un système d'où il provient.

Méthodes

Techniques pour isoler des gènes spécifiques L'identification des gènes peut être réalisée à l'aide de méthodes informatiques connues sous le nom de techniques de criblage hétérologue. Une bibliothèque numérique de séquences d'ADNc contient des données provenant de nombreux projets de séquençage et permet d'accéder facilement aux informations sur les séquences de gènes connus.

Si une séquence génomique est inconnue ou indisponible, l'ADN est soumis à un processus de fragmentation aléatoire, de clonage et de criblage afin de déterminer son phénotype. Bien que diverses méthodes puissent être utilisées pour obtenir un gène particulier, la manière la plus simple de révéler les composants d'une séquence d'ADN inconnue est d'abord d'identifier ses enzymes de restriction. Les enzymes de restriction sont des enzymes responsables du clivage de l'ADN en fragments sur un site spécifique au sein de molécules appelées sites de restriction. Ces enzymes peuvent se trouver dans des bactéries ou des archées et sont connues pour protéger l'ADN de l'invasion étrangère des virus. Les enzymes de restriction sont distinctes et chacune ne reconnaît qu'une séquence spécifique de paires de bases dans l'ADN, dont beaucoup ont tendance à être palindromiques. En localisant chaque enzyme, la séquence associée à l'enzyme de restriction peut être identifiée et isolée.

Si la séquence est connue, une technique appelée réaction en chaîne par polymérase (PCR) peut être utilisée pour isoler un gène d'intérêt. L'objectif de la PCR est non seulement d'identifier, mais aussi d'amplifier un segment d'ADN particulier par des phases de dénaturation, de recuit et d'extension. La dénaturation place une matrice d'ADN double brin dans des conditions de température élevée (95 °C) afin de rompre ses faibles liaisons hydrogène et d'assurer la séparation des brins. Le recuit refroidit la réaction pour permettre aux liaisons hydrogène de se reformer et favoriser la liaison des amorces à leurs séquences complémentaires sur la matrice d'ADN simple brin. Enfin, l'étape d'extension implique que l'ADN polymérase reconnaissant l'ADN simple brin amorcé, et donc isolant des séquences spécifiques nécessaires à la réplication.

Techniques d'incorporation de gènes dans l'hôte

Administration par pistolet génétique/Biolistique L'administration par pistolet à gènes /biolistique est une méthode attrayante pour l'administration de gènes en raison de ses propriétés non virales et, en plus de la transduction virale, c'est l'une des méthodes les plus courantes. Cette méthode permet de réduire les réactions immunitaires indésirables et le risque d'infection virale par rapport aux méthodes de transfert basées sur les virus. Plutôt que d'utiliser un vecteur viral, cette technique fait appel à des méthodes physiques, en particulier à la propulsion à l'hélium pour délivrer des vecteurs de transformation. Le transfert par canon à gènes est traditionnellement utilisé pour la production de plantes transgéniques, car il permet de pénétrer efficacement les parois cellulaires. Plus récemment, cette technique s'est avérée efficace dans les cellules animales qui ne peuvent tolérer un bombardement de haut niveau, où les particules d'or de l'ADN sont délivrées à une pression d'hélium plus faible. Cette méthode est utilisée avec succès à la fois in vitro et in vivo.

Électroporation L'électroporation est une méthode qui utilise une haute tension pour créer des pores dans les membranes des cellules de mammifères. En pulsant l'électricité, des zones locales de la membrane cellulaire se déstabilisent transitoirement et l'ADN peut alors pénétrer dans la cellule. Lorsque l'intensité du champ est appropriée, les dommages causés à la cellule hôte sont minimes. Cette technique peut être utilisée pour les transfectants à court et à long terme. Elle est également efficace avec presque tous les types de tissus et a montré des niveaux élevés de transfert de gènes avec une augmentation de la distribution des cellules exprimant l'ADN.

Transduction virale La transduction virale est une méthode qui fait appel à des vecteurs viraux et qui est utilisée pour l'introduction stable de gènes dans les cellules cibles. Dans cette méthode, le vecteur viral (virion) infecte les cellules hôtes en transportant directement l'ADN dans le noyau de la cellule. Les deux types de virus couramment utilisés pour la transduction sont les adénovirus, qui ont tendance à être transitoires, et les lentivirus, qui intègrent l'ADN dans le génome. Les vecteurs lentiviraux sont également un outil viral intéressant car ils peuvent transduire dans des cellules qui ne se divisent pas, ce qui permet un transfert stable dans une large gamme de types de cellules hôtes.

Lipofection Dans la lipofection, le gène est injecté à l'aide de liposomes. La séquence d'ADN est encapsulée dans un liposome dont la composition est identique à celle de la membrane cellulaire. Cette méthode lui permet de fusionner directement avec la membrane ou d'être endocytosé, ce qui libère l'ADN dans la cellule. La lipofection est souvent utilisée parce qu'elle fonctionne avec de nombreux types de cellules, qu'elle est hautement reproductible et qu'il s'agit d'une méthode rapide pour l'expression stable et transitoire.

Systèmes hôtes Les gènes sont souvent soumis à une expression hétérologue pour étudier des interactions protéiques spécifiques. E. coli, la levure (S. cerevisiae, P. pastoris), les cellules de mammifères immortalisées et les ovocytes d'amphibiens (c'est-à-dire les œufs non fécondés) ont couramment utilisés pour les études nécessitant une expression hétérologue. Le choix d'un système particulier doit tenir compte d'aspects économiques et qualitatifs. L'expression procaryote est largement utilisée dans la technologie de l'ADN recombinant pour former des protéines facilement manipulables par des méthodes génétiques bien connues avec un milieu peu coûteux. Parmi les limitations, on peut citer l'accumulation intracellulaire de protéines hétérologues, le mauvais repliement du peptide, l'absence de modifications post-transcriptionnelles, le risque de dégradation du produit en raison de traces d'impuretés protéasiques et la production d'endotoxines.

Des systèmes procaryotes et eucaryotes, le plus souvent des bactéries, des levures, des insectes et des cellules de mammifères, et parfois des amphibiens, des champignons et des protistes, sont utilisés pour les études qui nécessitent une expression hétérologue. Les bactéries, en particulier E. coli, les levures (S. cerevisiae, P. pastoris), les insectes et les cellules d'amphibiens (ovocytes) sont utilisés comme hôtes efficaces pour l'expression de protéines étrangères. En général, les procaryotes sont plus faciles à utiliser et mieux compris et constituent souvent le système hôte préféré. Ils sont largement utilisés dans la technologie de l'ADN recombinant pour former des protéines facilement manipulables par des méthodes génétiques bien connues avec un milieu peu coûteux. Pour les protéines membranaires cependant, les chercheurs ont observé que les cellules de mammifères sont plus efficaces. Cela s'explique par l'absence de modifications post-transcriptionnelles dans les systèmes procaryotes. Les limites comprennent l'accumulation intracellulaire de protéines hétérologues, un mauvais repliement du peptide, le risque de dégradation du produit en raison de traces d'impuretés de la protéase et la production d'endotoxines.

Escherichia coli Un système populaire utilisé est Escherichia coli en raison de son taux de croissance rapide (~ 20 à 30 minutes), de sa capacité de fermentation continue et de son coût relativement faible. En outre, la levure a la capacité d'exprimer un volume relatif élevé de protéines hétérologues. Plus précisément, jusqu'à 30 % des protéines produites dans la levure peuvent être le produit d'un gène hétérologue. Il existe également des souches sûres d'E. coli qui sont générées avec succès pour augmenter la production. Outre les propriétés attrayantes d'E. coli en tant qu'hôte, cet hôte est incroyablement populaire car les chercheurs disposent d'une grande quantité de connaissances sur sa génétique, y compris la séquence génomique complète. Cependant, des problèmes se posent, soit en raison de la séquence du gène d'intérêt, soit en raison des limites d'E. coli en tant qu'hôte. Par exemple, les protéines exprimées en grandes quantités dans E. coli ont tendance à précipiter et à s'agréger, ce qui nécessite alors une autre méthode de dénaturation, de renaturation et de récupération. Enfin, E. coli n'est optimale que dans des conditions spécifiques qui dépendent du gène inséré.

Bacillus subtilis Bacillus subtilis (B. subtilis) est un organisme gram positif non pathogène qui ne produit pas de lipopolysaccharides Les LPS, que l'on trouve dans les bactéries à Gram négatif, sont connus pour provoquer de nombreux troubles dégénératifs chez l'homme et l'animal et pour affecter la production de protéines chez E. coli. Par conséquent, bien qu'il soit considéré comme potentiellement sûr, B. subtilis n'est pas officiellement classé comme étant généralement considéré comme sûr par la FDA (GRAS). B. subtilis possède des caractéristiques génétiques qui lui permettent de se transformer facilement avec des bactériophages et des plasmides. De plus, il peut faciliter davantage d'étapes de purification par sécrétion directe dans le milieu de culture et peut facilement être mis à l'échelle en raison de sa capacité à sécréter ces protéines de manière non spécifique. À ce jour, B. subtilis est utilisée avec succès pour étudier différents mécanismes biologiques, notamment le métabolisme, la régulation des gènes, la différenciation, l'expression des protéines et la génération de produits bioactifs. Il s'agit également de la bactérie gram-positive la plus étudiée au monde, les informations génomiques étant largement disponibles. Parmi les inconvénients de ce système hôte, citons la réduction ou la non-expression de la protéine d'intérêt et la production de protéases extracellulaires dégradantes qui ciblent les protéines hétérologues. Enfin, malgré les propriétés attrayantes de B. subtilis, ces limitations font que E. coli est le système hôte par défaut par rapport à B. subtilis. Cependant, avec davantage de recherche et d'optimisation, B. subtilis a le potentiel de produire des protéines membranaires à grande échelle.

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