Microscopie en champ sombre

thumb|1 - Un branchiopode éclairé en champ sombre thumb|right|2 - Un peracarida (mysidacé) éclairé en champ sombre

La microscopie en champ sombre est une variante de la microscopie optique connue déjà depuis plus de 250 ans. Elle conduit à un arrière-plan sombre de l'image, sur lequel les structures à observer se détachent en clair. On peut ainsi obtenir d'échantillons transparents, avec un faible contraste, des images bien résolues, contrastées, sans nécessiter une coloration préalable de l'objet. Même des échantillons vivants sont observables ainsi. Jusqu'au développement de la microscopie à contraste de phase dans les années 1930, la microscopie à fond sombre était la seule méthode de renforcement du contraste pour des objets non colorés. Pour la différencier de la microscopie à fond sombre, la technique de microscopie optique « normale » est désignée par microscopie à fond clair.

Le principe de la microscopie à fond sombre repose sur le fait que les objets ne font pas qu'absorber la lumière, mais aussi qu'ils en dévient une partie. Si l'éclairage est disposé de façon que les rayons directs, non déviés, n'atteignent pas l'objectif, l'observateur ne voit que des rayons déviés. Une des causes de déviation est la diffusion de la lumière connue sous le nom d'effet Tyndall sur des petites particules. On observe cet effet par exemple quand la lumière tombe dans une pièce sombre, et que la poussière devient visible dans le rayon lumineux. Même des particules qui sont plus petites que le pouvoir de résolution du microscope dévient la lumière, et se manifestent dans un microscope à fond sombre. On peut ainsi étudier beaucoup de propriétés des particules, comme leur mobilité. Cette application a eu au début du une grande importance.

L'éclairage de l'objet peut avoir lieu à l'opposé de l'objectif (par transmission), du même côté (par réflexion) ou même de côté. Les deux premiers peuvent être utilisés tant pour les microscopes monoculaires que pour les stéréomicroscopes.

Comparaison entre champ clair et champ sombre

thumb|upright=1.35|4 - Empreinte digitale sur le porte-objet sous différentes conditions d'éclairage. À gauche, champ clair avec condenseur ouvert, au centre, condenseur fermé, à droite, champ sombre. Les parties encadrées sont reproduites en bas agrandies par trois, pour faire voir les artéfacts de réfraction sur les particules et les rayures avec un diaphragme de condenseur trop fermé. Dans ce cas, des taches foncées apparaissent, qui autrement seraient diffuses. En champ sombre, les traces d'empreintes digitales sont visibles au mieux, les particules et les rayures sont surexposées.

Champ clair et champ sombre en éclairage par transmission

L'éclairage par transmission désigne une disposition où l'éclairage de l'objet provient du côté opposé à l'objectif, la lumière traversant l'échantillon (transmission), et atteignant l'objectif. Cette microscopie normale par transmission en champ clair est la variante la plus souvent utilisée en biologie et médecinein : , et on la trouve aussi dans les microscopes scolaires.

Dans la microscopie par transmission en champ clair, le contraste de l'image arrive surtout par le fait qu'une partie de l'échantillon absorbe une partie de la lumière projetée, et le domaine concerné apparaît donc plus sombre (Cf. Fig. 3 g.). Mais beaucoup d'objets microscopiques sont largement transparents, ou très petits, et n'absorbent donc que très peu de lumière. Dans le microscope à champ clair, ils ne font qu'un contraste très faible, et sont donc difficiles à repérer devant le fond clair (Cf. Fig. 4, g.). Mais ces objets peuvent dévier la lumière, c'est-à-dire changer la direction de certains rayons, par diffusion Rayleigh, par réfraction, par diffraction et/ou réflexion. En éclairage en champ clair, ces déviations ne s'observent pratiquement pas, parce que l'intensité des rayons déviés est bien plus faible que celle du fond clair. On peut augmenter le contraste en champ clair dans certaines limites, en prenant un diaphragme plus étroit dans la voie de l'éclairage (diaphragme sur le condenseur) (Cf. Fig. 4, c.). Mais cela renforce les aberrations, et il se forme au bord des objets des motifs de diffraction gênants (Cf. les petits extraits de la Fig. 4).

En microscopie par transmission en champ sombre, l'échantillon est éclairé de derrière de telle façon que l'éclairage ne tombe pas directement dans l'objectif. Seule la lumière déviée par l'échantillon atteint l'objectif. Le fond de l'image apparaît donc sombre, tandis que les objets de l'échantillon paraissent clairs (Cf. Figs. 3 et 4, d.). Ceci fonctionne aussi et surtout pour des échantillons très transparents. Alors que les différences de brillance de la lumière déviée sont difficiles à reconnaître en champ clair, en raison de la haute brillance du fond, ces différences apparaissent substantiellement plus clairement en champ sombre. Les fines traces de graisse de l'empreinte digitale (Fig. 4, d.) deviennent clairement visibles. Les saletés déjà visibles en champ clair (particules et rayures) présentent en champ sombre un contraste tellement fort qu'elles n'apparaissent sur l'image que comme des taches claires, surexposées.

En éclairage par transmission en champ sombre, il est particulièrement important de maintenir rigoureusement propres le porte-objet, le couvre-objet et les surfaces de verre du microscope, parce que tout grain de poussière contribuera par sa diffusion de la lumière au bruit de fond de l'arrière-plan. Également, les structures qui dévient la lumière ne doivent pas apparaître superposées sur plusieurs plans, sinon leurs signaux se superposent. Par suite, l'éclairage en champ sombre n'est pas approprié pour des échantillons plus épais, comme les coupes de tissus typiques.

Physiquement, l'éclairage en champ sombre est décrit comme un éclairage pour lequel la tache de diffraction la plus intense (voir figure de diffraction) ne pénètre pas dans le plan focal arrière de l'objectif. Seuls des rayons déviés, par exemple des maxima secondaires de la figure de diffraction, participent à la formation de l'image.

Microscopie en champ sombre hors de la microscopie optique

Les concepts de champ sombre et de champ clair sont transposables à des domaines où l'image n'est pas formée par la lumière, mais par d'autres types de signaux. On distingue ainsi les cas où les signaux émis sans déviation atteignent le détecteur de signaux (champ clair), ou ne l'atteignent que quand ils ont été déviés par l'échantillon (champ sombre). On a ainsi des procédés en champ sombre par exemple en microscopie électronique (voir microscope électronique en transmission à balayage) et en microscopie acoustique.

Éclairage en champ sombre pour les microscopes par transmission actuels

thumb|upright=0.8| 5 - Microscope en champ sombre avec diaphragme central. L'éclairage vient ici d'en dessous, et est représenté en jaune. La partie occultée par le diaphragme central est représentée en gris foncé. 1 - Diaphragme central, 2 - Condenseur, 3 - Cône lumineux, 4 - Plan de l'échantillon, 6 - Objectif.

La possibilité la plus simple avec un microscope par transmission normal avec source lumineuse, condenseur et objectif avec illumination de Köhler pour faire un éclairage en champ sombre consiste en une fermeture étroite du diaphragme du condenseur, et à un décalage latéral suffisant pour que plus aucune lumière directe ne tombe sur l'objectif. L'éclairage n'a plus lieu que d'un côté. Cependant, les microscopes modernes n'ont généralement pas la possibilité de déplacer le diaphragme relativement au condenseur.

Bases communes

De meilleures qualités d'image sont obtenues avec un condenseur centré au moyen d'une installation complémentaire. Cette installation complémentaire limite l'éclairage de l'échantillon à un cône lumineux (en jaune sur la fig. 5). La partie interne du cône n'est pas éclairée (en gris foncé). Le cône provenant du condenseur est focalisé sur le plan de l'échantillon, et s'élargit ensuite dans le cas le plus simple, si bien que la lumière non déviée passe entièrement à côté de l'ouverture de l'objectif, et l'arrière-plan de l'image reste sombre. Pour pénétrer dans l'objectif, la lumière doit avoir été déviée par l'échantillon à observer, et elle forme ainsi une image avec des structures claires sur un fond sombre. Tous les éclairages par transmission à fond sombre actuels forment un cône de lumière, cependant, celui-ci ne traverse pas toujours la totalité de l'échantillon : il arrive souvent que la lumière non déviée soit renvoyée par réflexion totale à la surface de la lamelle couvre-objet.

Pour créer le cône de lumière de l'éclairage, on utilise deux procédés différents. Un diaphragme central sous le condenseur est facile à fabriquer et à manipuler, bon marché et donc largement répandu. Ce procédé s'applique surtout aux objectifs de faible grossissement, pour lesquels on peut ajuster l'épaisseur du cône lumineux à l'objectif utilisé par simple changement. Des condenseurs spéciaux pour le champ sombre utilisent plus à fond la lumière au moyen de miroirs et peuvent être adaptés aux exigences d'objectifs à grossissements supérieurs, par l'immersion. La qualité de l'image en est meilleure.

Quand le cône lumineux d'éclairage passe à travers l'échantillon, comme sur la Fig. 5, il faut qu'il évite l'entrée de l'objectif. Un éclairage en champ sombre n'est possible que si l'angle de la lumière sortant du condenseur (angle d'ouverture) est plus grand que l'angle de la lumière captée par l'objectif. Plus l'angle d'ouverture de l'objectif ou du condenseur est grand, meilleure est la résolution maximale possible. Au lieu de l'angle d'ouverture, on utilise souvent pour les objectifs et condenseurs l'ouverture numérique, qui peut atteindre 0,95 sans immersion, et avec immersion dans l'huile jusqu'à environ 1,4. Pour l'éclairage en champ sombre, il faut que l'ouverture numérique du condenseur soit supérieure à celle de l'objectif utilisé. Sans immersion du condenseur, l'utilisation du champ sombre est limitée à des objectifs d'ouverture numérique de 0,75 au plus. Les objectifs au grandissement de 40×, que l'on utilise sans immersion ont couramment une ouverture numérique de 0,65.

Éclairage avec diaphragme central

thumb|left|upright=1.2|6 - Cône lumineux pour l'éclairage en champ sombre, formé avec un diaphragme central. Un porte-objet coloré a été disposé verticalement dans le trajet des rayons pour le rendre visible. L'éclairage vient du dessous du condenseur et passe en haut sur le côté de l'objectif. Pour l'étude, on dispose l'échantillon sur la platine en sorte qu'il soit au point le plus brillant. thumb|upright=0.7|7 - Le diaphragme central, vu ici de dessus, est opaque au centre (noir), transparent sur le bord (jaune). Un diaphragme annulaire est ici utilisé sur un microscope autrement normalement à champ clair. Ce diphragme (1 sur la Fig. 5) présente un bord ou anneau transparent, et diminue ainsi l'éclairage obtenu par un condenseur (2) normal en un cône lumineux (3). Pour utiliser l'ouverture du condenseur au mieux, on en utilise une partie allant le plus loin possible vers l'extérieur. Plus l'ouverture de l'objectif utilisé est grande, plus grand doit être le diamètre de la surface opaque centrale, et l'éclairage en diminue d'autant. De la platine avec le porte-objet (4), la lumière évite ainsi de passer par l'objectif (6). La lumière atteignant l'objectif doit avoir été déviée par les structures de l'échantillon (5). Le diaphragme central peut être inséré comme un tiroir sous la lentille du condenseur d'un microscope par transmission normal.