Le fractionnement isotopique naturel spécifique par résonance magnétique nucléaire (RMN-FINS ou en anglais SNIF-NMR pour ) est une méthode qui permet avec une très grande précision de quantifier les différences de teneurs isotopiques sur chacun des sites d’une molécule et donc de mesurer le fractionnement isotopique naturel spécifique correspondant à chaque site de cette molécule.

L'analyse RMN-FINS est principalement utilisée pour vérifier l'authenticité des vins G. Martin, C. Guillou, Y.L. Martin, Natural Factors of Isotope Fractionation and the characterization of Wines, J. Agric. Food Chem., , 1988, 316-322 , spiritueux, jus de fruits M. Lees, G.G. Martin, P. Rinke, M. Caisso, The Combined Use of Available Analytical Tools: the Only Way to Combat Fruit Juice Adulteration, Fruit Processing, Fruit Processing 7/96, miels Association of Official Analytical Communities, Official Methods of Analysis of AOAC International, méthode 998.12 (ex 978.17) et 998.18 (ex 991.41), honeys authentication, sucres et vinaigres C. Vallet, M. Arendt, G. Martin, Site specific isotope fractionation of Hydrogen in the oxidation of ethanol into acetic acid. Application to vinegars, Biotechnology Techniques, 2 , 1988 ainsi que pour contrôler la naturalité de certains composés aromatiques (anéthol, benzaldéhyde, frambinone, vanilline)G. Martin, M. Martin, F. Mabon, J. Bricout, « La Résonance Magnétique Nucléaire du Deutérium en Abondance Naturelle, une nouvelle méthode d’identification de l’origine de produits alimentaires appliquée à la reconnaissance des Anétholes et des Estragoles », Sciences des Aliments, 1983. G. Remaud, A.A. Debon, Y.-L. Martin, G.G. Martin et G.J. Martin, Authentication of Bitter Almond Oil and Cinnamon Oil: Application of the SNIF-NMR Method to Benzaldehyde, J. Agric. Food Chem., , 1997. AOAC Official Method 2006.05, Site-Specific Deuterium/Hydrogen (D/H) Ratios in Vanillin, AOAC International 2007.. La méthode RMN-FINS a été adoptée par l'Organisation internationale de la vigne et du vin (OIV) et l'Union européenne comme méthode officielle pour l'analyse du vin Commission Regulation of the European communities, 1990 (EEC) 000/90 : Determining community methods for the analysis of wine, Bruxelles, Official Journal of the European communities, .. C'est également une méthode officielle pour l' () dans l'analyse des jus de fruits AOAC official Method 995.17, Beet Sugar in Fruit Juices, SNIF-NMR, AOAC International 1996, sirops d'érable Yves-Loïc Martin, N. Christoph, A.-I. Blanch-Cortès , Detection of Added Beet or Cane Sugar in Maple Syrup by the Site-Specific Deuterium Nuclear Magnetic Resonance (SNIF-NMR) Method: Collaborative Study, J. AOAC Int., 2001, 84, , 1509-1521, vanilline et par le Comité européen de normalisation (CEN) pour l’analyse du vinaigre.

Historique À l'origine la méthode RMN-FINS fut développée en réponse à un appel d'offres gouvernemental par le Gérard Martin, Maryvonne Martin et leur équipe à l'université de Nantes, dans le but de détecter l’ajout de sucre dans les vins (chaptalisation) et l'enrichissement des moûts de raisin. 1981 : invention de la méthode RMN-FINS par le Gérard Martin, son épouse, Maryvonne Martin, et leur équipe à l’université de Nantes / CNRS. 1987 : création des Laboratoires Eurofins Scientific à Nantes - spécialisés dans l’analyse des vins - et achat des droits d’exploitation du brevet CNRS. Ce brevet est maintenant public et le nom SNIF-NMR est une marque déposée. L’OIV l’adopte comme méthode officielle. 1987-1990 : développement et application de la méthode RMN-FINS à l’analyse des jus de fruits et de certains arômes naturels 1990 : la méthode RMN-FINS est reconnue par l’Union européenne comme méthode officielle pour l’analyse des vins. Mise en œuvre de la méthode RMN-FINS pour les laboratoires officiels en Europe 1990-1992 : la méthode est testée sur de nouveaux composés aromatiques. 1996 : la méthode RMN-FINS est officialisée aux États-Unis par l’AOAC pour les jus de fruits. Mise en œuvre de la méthode RMN-FINS pour les laboratoires officiels aux États-Unis 2001 : la RMN-FINS est reconnue par l'AOAC pour la vanilline. 2013 : la RMN-FINS est reconnue par la CEN pour l’acide acétique. Mise en œuvre de la méthode RMN-FINS pour les laboratoires officiels en Asie

Principe Répartition isotopique Dans la nature, les atomes de protium (1H), d'oxygène 16 (16O) et de carbone 12 (12C) coexistent dans certaines proportions avec leurs isotopes stables, respectivement deutérium (2H ou D), oxygène 18 (18O) et carbone 13 (13C), comme l'indique le tableau ci-dessous d'abondance naturelle de quelques isotopes.

+ Tableau d'abondance naturelle d'isotopes Isotopes de l'hydrogène Isotopes du carbone Isotopes de l'oxygène Isotope 1H 2H 3H 12C 13C 14C 16O 17O 18O Nombre de masse (A) 1 2 3 12 13 14 16 17 18 Abondance naturelle (%) 99,985 0,015 Radioisotope pratiquementinexistant dans la nature 98,904 1,096 Radioisotopeextrêmement rare 99,763 0,037 0,2

D'une façon générale, les rapports isotopiques dans les molécules naturelles sont la résultante :

des conditions géoclimatiques – pour les produits naturels ;

des effets chimiques et biochimiques - comme le métabolisme de photosynthèse des plantes.

Ce phénomène est connu en tant que le fractionnement isotopique naturel.

L’empreinte isotopique résultante peut donner des informations sur l’origine botanique, synthétique ou géographique de la molécule ou du produit.

Principe général Le principe de la RMN-FINS est basé sur : « le fractionnement isotopique naturel ». Deux noyaux sont utilisés pour les méthodes d’analyses de l’authenticité des aliments : l’hydrogène : la méthode 2H-RMN-FINS est l’application historique de la RMN-FINS, elle mesure le ratio de deutérium/hydrogène sur chacun des sites de la molécule analysée ; le carbone : la méthode 13C-RMN-FINS a ouvert de nouvelles possibilités d’analyse pour la RMN-FINS (nouvelles molécules, nouvelles applications). Cette méthode mesure le ratio 13C/12C pour chacun des sites de la molécule.

Étapes de la méthode

La RMN-FINS est utilisée sur des molécules pures ou purifiées. C’est pourquoi certaines étapes de préparation doivent être effectuées par le laboratoire avant l’analyse.

Fermentation (pour les jus de fruits). Extraction quantitative de l’éthanol par distillation. Préparation standard des échantillons RMN. Acquisition RMN. Interprétation des résultats et rapport sur l’authenticité.

À chaque étape de l'analyse RMN-FINS, des efforts doivent être faits pour éviter des fractionnements isotopiques parasites. Des mesures contrôles, telles que la détermination du titre alcoométrique des produits intermédiaires pour l'analyse de jus fermenté ou distillé sont effectuées sur chaque échantillon.

Avantages de la méthode

Les rapports isotopiques d'une molécule peuvent être déterminés par spectrométrie de masse à rapport isotopique (IRMS), la quantité d'échantillon utilisée pour l’IRMS est beaucoup plus faible que celle utilisée pour la RMN, et il est possible de coupler le spectromètre de masse à un système chromatographique pour permettre la purification ou l’analyse de plusieurs constituants d'un mélange complexe. Cependant l’échantillon est brûlé après une transformation physique comme la combustion ou la pyrolyse. On obtient alors une valeur moyenne de la concentration de l’isotope étudié sur l'ensemble des sites de la molécule. C’est la méthode AOAC officielle utilisée pour obtenir le rapport moyen 13C/12C (ou δ 13C) des sucres ou d’un alcool et la méthode officielle CEN et OIV pour l’analyse du rapport 18O/16O dans l’eau.

La méthode RMN-FINS est en mesure de déterminer, à un niveau élevé de précision, les rapports isotopiques pour chacun des sites de la molécule, ce qui permet une meilleure discrimination. Par exemple, pour de l'éthanol (CH3CH2OH), les trois ratios ((D/H) CH3, (D/H) CH2 et (D/H) OH) peuvent être obtenus.

Exemples d'utilisations de la 2H-RMN-FINS

Application pour les jus de fruits et le sirop d'érable Méthode officielle AOAC pour détecter l’ajout de sucre dans un jus de fruits ou dans le sirop d’érable. C’est la seule méthode qui détecte l’addition de ( sucre de betterave).

Spectre RMN (exemple de la méthode 2H-RMN-FINS)

Pour un jus de fruits par exemple, après transformation de tous les sucres fermentescibles en alcool, la molécule d'éthanol coexiste naturellement avec trois isotopologues monodeutérés (CH2D-CH2-OH, CH3-CHD-OH et CH3-CH2-OD). Leur présence relative peut alors être quantifiée avec précision G. Martin, M.L. Martin, Modern Methods of Plant Analysis: The Site-Specific Natural Isotope Fractionation-NMR Method Applied to the Study of Wines, éditeurs : HF Linskens et JF Jackson Springer Verlag, Berlin, 1988, 258-275.. Sur le spectre RMN du deutérium suivant (), un pic correspond à chacun des trois isotopologues observés dans l'éthanol. Pour la méthode AOAC officielle, les ratios de (D/H) CH3 et (D/H) CH2 sont calculés par comparaison avec un standard interne, la tétraméthylurée (TMU), qui a une valeur de (D/H) certifiée.

Interprétation des valeurs isotopiques RMN-FINS

La figure ci-dessous regroupe le principe d’interprétation de : résultats mesurés par IRMS (la déviation isotopique δ 13C), qui permettent de différencier les plantes en fonction de leur métabolisme photosynthétique ( comme le maïs opposé au C3 comme la betterave, l’orange ou le raisin) ; avec des résultats de RMN-FINS ((D/H)I) qui peuvent différencier l’origine botanique de sucres au sein du même groupe métabolique (la betterave opposée à l’orange ou le raisin). Les valeurs obtenues sur un échantillon d'analyse sont ensuite comparées avec les valeurs des échantillons authentiques de la base de données.

Application à l'authentification de l'origine des vins

La RMN-FINS est la méthode officielle de l’OIV pour déterminer l’origine du vin. C’est la seule méthode à détecter l’addition de (comme le sucre de betterave).

Les paramètres isotopiques de l'eau et de l'éthanol sont liés à l’humidité et la température de la zone de culture de la plante. Par conséquent, l'examen des données météorologiques de la région et de l'année de culture permet de faire un diagnostic. Dans le cas du vin et des fruits, les paramètres isotopiques de l’éthanol ont montré qu’ils répondaient à de faibles variations environnementales et qu’ils caractérisent efficacement la région de production Martin G.J., Guillou C., Martin M.L., Cabanis M.T., Tep Y., Aerny J., J. Agric. Food Chem. 1988;36:316–22..

Depuis 1991, une banque de données isotopiques est coordonnée par le Centre commun de recherche de la Communauté européenne (EC-JRC en anglais) concernant les vins de tous les États membres de l'Union européenne producteurs de vin. Le fichier contient plusieurs milliers d'entrées pour les vins européens et est maintenu à jour chaque année. Cette base est accessible pour tous les laboratoires publics officiels. Les entreprises privées impliquées dans le contrôle des aliments et boissons ont également construit leurs propres banques de données.

Ainsi, en comparant le fractionnement isotopique naturel spécifique correspondant à chaque site d’une molécule d’éthanol d’un vin, avec celui d’une molécule connue et référencée dans une base de données, on peut contrôler l’origine géographique, botanique et la méthode de production et donc vérifier l’authenticité du vin.

Application pour le vinaigre et l'acide acétique

Les origines de vinaigres obtenus par oxydation bactérienne ou par oxydation chimique d’éthanol provenant de la fermentation de sucres divers, peuvent être identifiées par la 2H-RMN-FINS. Cela permet de contrôler la qualité du vinaigre et de déterminer s’il provient de la betterave ou canne à sucre, du vin, du malt, du cidre, d'autres origines ou d'une synthèse chimique.

Application pour la vanilline