CRISPR

vignette|368x368px|CRISPR/Cas9. thumb|500px|right|Diagramme du mécanisme de CRISPR.

En génétique, CRISPR (prononcé ), acronyme de , sont des familles de séquences répétées dans l'ADN bactérien et celui des archées. De telles familles se caractérisent par des séries de répétitions directes courtes (de 21 à 37 paires de bases) et régulièrement espacées par des séquences appelées , généralement uniques, de 20 à 40 paires de bases.

En génie génétique, le système CRISPR-Cas9, d'abord utilisé pour typer des souches de bactéries est récemment devenu un outil de manipulation génétique à fort potentiel. CRISPR-Cas9 est notamment utilisé comme ciseau moléculaire afin d'introduire des modifications locales du génome (manipulations souvent qualifiées d'édition génomique) de nombreux organismes modèles.

Première observation et redécouvertes Cette structure répétée a été observée pour la première fois par Yoshizumi Ishino en 1987 chez Escherichia coli. Elle a ensuite été décrite plusieurs fois sous différents noms :

LCTR pour . Deux de ces régions sont associées à des LCTR (typique des Archæa) ce qui supporte l’idée que ces LCTR soient impliqués dans le transfert de gènes ; SPIDR pour ; TREP pour ; DVR pour ; SRSR pour .

Un article de Juan Francisco Martínez Mojica de 2000 démontre que toutes les descriptions précédentes n'étaient que des facettes d'une seule et même entité. En 2002, Jansen décide, avec l'accord du groupe de Mojica, de clarifier la nomenclature en créant l'acronyme CRISPR.

Si la séquence répétée est bien conservée au sein d'un organisme, le nombre d'unités au sein d'un train, le nombre de trains et même la présence de trains sont des quantités hautement variables d'une lignée à une autre. De fait, les CRISPR ont été utilisés pour typer des souches bactériennes, une technique appelée spoligotypage.

Répartition dans le monde vivant Ces répétitions se rencontrent dans les lignées d'archées et de bactéries, mais n'ont pas encore été observées chez les eucaryotes. Chez les virus, il a été montré que des bactériophages codent le système CRISPR-Cas. Les CRISPR pourraient être la famille de répétition la plus largement répandue dans le monde vivant, avec un peu moins de la moitié des organismes séquencés porteurs de ce type de répétitions (sur plus de 200 génomes testés à la fin de 2005). Les régions CRISPR sont présents chez la plupart des archées thermophiles et la moitié des espèces bactériennes (jusqu'à 10 % du génome chez certaines archées analysées), concernant aussi bien les bactéries à Gram+ que les bactéries à Gram-. Certains plasmides d'archées sont porteurs de CRISPR homologues de ceux portés par l'organisme hôte. C'est le cas par exemple de Sulfolobus et du plasmide pNOB8. Certains auteurs ont signalé la présence de CRISPR dans l'ADN mitochondrial (Flamand, 1992), mais ces résultats n'ont pas pu être reproduits.

Origine évolutive Chez les bactéries, les systèmes CRISPR de classe 2 reposent sur une enzyme Cas unique, tandis que les systèmes de classe 1 utilisent des assemblages multiprotéiques. L'origine des systèmes de classe 2 est bien comprise : trois protéines distinctes codées par des transposons (IscB, IsrB et TnpB) sont des nucléases à ADN guidées par ARN, naturellement présentes et reprogrammables. On peut reconstituer l'évolution des systèmes CRISPR-Cas9 à partir des transposons IS200/IS605. IscB utilise un ARN non codant unique pour le clivage de l'ADN double brin guidé par ARN. TnpB, une autre protéine codée par les transposons IS200/IS605, a également une activité de nucléase guidée par ARN et c'est l'ancêtre probable des endonucléases Cas12. Ces systèmes nouvellement caractérisés, baptisés systèmes OMEGA (pour , « activité guidée par un élément mobile obligatoire »), sont présents dans tous les domaines du vivant. ; Cas13 a probablement évolué à partir d'AbiF, une protéine codée par un gène lié à l'infection abortive et stablement associé à un ARN non codant bien conservé. Une Cas13 miniature, dite Cas13e, constitue un intermédiaire évolutif entre AbiF et les autres Cas13 connues. Malgré ce lien de parenté, leurs fonctions diffèrent : alors que Cas13e est un système ciblant l'ARN et guidé par l'ARN, AbiF est un système toxine-antitoxine doté d'une antitoxine à ARN.. L'origine des systèmes de classe 1 est longtemps restée insaisissable. En 2026 sont identifiés des systèmes VIPR (, « répétitions programmables d'interférence virale »), qui constituent une origine plausible pour les effecteurs CRISPR multi-unités... Une guerre virale ancestrale pourrait être à l'origine de ces systèmes modernes de défense bactérienne CRISPR de classe 1..

Structure

Les locus CRISPR sont caractérisés par une alternance de répétitions directes ou « » (c'est-à-dire toutes orientées dans le même sens de lecture), courtes (de 21 à 37 paires de bases) et régulièrement espacées par des séquences appelées « », généralement uniques, de 20 à 40 paires de bases. Les séquences nucléotidiques et la longueur des locus CRISPR sont conservées pour une même espèce, mais varient d'une espèce à l'autre. Les locus CRISPR sont généralement adjacents aux gènes cas (pour « »), dont ils sont séparés par une séquence de 300 à 500 paires de bases, appelée séquence « ».

Les premiers éléments sur la façon dont la structure CRISPR elle-même (c'est-à-dire la portion constituée de la succession de et de ) évolue ont été fournis par le travail de Pourcel et al.. Ce travail, portant sur les locus CRISPR de Yersinia pestis, a montré que l'acquisition de nouveaux était polarisée, alors que la perte d'un ou plusieurs « » pouvait survenir tout au long du locus CRISPR. L'acquisition survient de façon adjacente au . Le est conservé dans la lignée mais pas entre les lignées.

Gènes Cas

Rencontrés uniquement dans les génomes porteurs de CRISPR, les gènes Cas (pour associés à CRISPR) sont généralement situés à proximité des locus CRISPR. Dès 2005, au moins de gènes de ce type ont été décrites. Les étant strictement associées. Le plus important de ces gènes est Cas1, présent dans presque tous les complexes CRISPR-Cas (parfois notés CRISPR/Cas). La distribution sporadique des sous-types CRISPR-Cas suggère plusieurs évènements de transferts horizontaux au cours de l'évolution microbienne. Les systèmes CRISPR-Cas peuvent être très étendus (jusqu'à 20 gènes différents) et semblent présenter des schémas différents d'une lignée à l'autre, qui ne se retrouvent que dans un nombre très limité d'espèces. Les gènes Cas repérés chez des organismes hyperthermophiles ont d'abord été vus comme jouant un rôle de réparation de l'ADN.

Fonctions Si les fonctions des CRISPR n'ont pas encore été clairement identifiées, un certain nombre d'hypothèses ont été avancées : les CRISPR sont impliqués dans la répartition des copies de génomes au cours de la division (expériences menées sur Haloferax mediterranei). Des similitudes avec certains mécanismes de partition de plasmides suggèrent que les CRISPR sont des analogues des séquences de partitionnement bactériennes. Sans être vital pour la cellule puisque certaines lignées en sont dépourvues ; les CRISPR ont un rôle de perturbateur chromosomique en permettant des recombinaisons et sont impliqués dans le système de restauration chromosomique à la suite d'un réarrangement : il a été montré qu'il y a une relation forte entre les CRISPR et les réarrangements. Le motif répété faciliterait les recombinaisons ; deux de ces régions sont associées à des LCTR (typiques des Archæa) ce qui supporte l’idée que ces LCTR sont impliqués dans le transfert de gènes. Nelson a proposé que les CRISPR sont associés à l'origine de réplication et jouent un rôle dans le processus de réplication du chromosome (il a placé le nucléotide 1 comme étant le premier d'un CRISPR) ; chez les archées, site de fixation pour la formation de nucléosomes (enroulement de l’ADN autour de protéines similaires à des histones) permettant de protéger l’ADN ou de réguler l’expression génique ; ces séquences forment des structures secondaires (épingles, Z-DNA et H-DNA) ayant des fonctions de régulation ou de protection.

Rôle « immunitaire » du système CRISPR-Cas

En 2005, on observe que les séquences de certains spacers sont identiques à celles de certains éléments génétiques mobiles, notamment de virus et de plasmides.

En , l'équipe de Philippe Horvath a montré que l'exposition de cellules porteuses de CRISPR à des phages entraîne l'apparition de nouveaux intervalles, que ces intervalles dérivent du matériel génomique des phages et que le retrait ou l'ajout de ces intervalles modifie la résistance des bactéries face aux phages.

Le système CRISPR-Cas (CASS) est un mécanisme de défense contre les phages et plasmides invasifs, fonctionnant d'une manière analogue à celle du système ARNi des eucaryotes. En intégrant des fragments de gènes étrangers dans des parties non codantes de leur chromosomes, archées ou bactéries acquièrent une résistance aux phages et plasmides. Il s'agit donc d'une forme de système immunitaire héritable par transmission aux cellules filles, permettant aux archées et aux bactéries de s'adapter rapidement à l'évolution des phages et des plasmides. En 2020, une étude explicite comment des marqueurs dérivés des génomes des différents virus rencontrés s'accumulent d'une manière chronologiquement ordonnée (à la manière d'un « enregistreur ADN ») dans la région CRISPR de leur génomeSungchul Kim , Selective loading and processing of prespacers for precise CRISPR adaptation, 2020. . C'est la phase d’immunisation. S'ensuit une immunité : les protéines Cas utilisent ces informations pour reconnaitre et désactiver tout virus de signature déjà connueLa Recherche, .

Il a été montré que les phages pouvaient contourner le système CRISPR-Cas via des gènes spécifiques.

Les systèmes CRISPR-Cas observés chez les bactéries et les archées d'une part et le système ARNi observé chez les eucaryotes d'autre part ne semblent pas dériver d'un ancêtre commun. Ils ne sont donc pas homologues.

Mécanismes moléculaires Les systèmes CRISPR utilisent les gènes cas1 et cas2 qui sont impliqués dans l'intégration, en tant que spacer de fragments de gènes étrangers dans le CRISPR.

Trois types de systèmes CRISPR-Cas sont connus. : les systèmes de types I, utilisent un complexe Cascade pour cliver les transcrits de CRISPR au niveau des épingles. Lorsqu'un complexe Cascade/spacer s'associe à un ADN cible (reconnaissance par hybridations) il recrute la protéine Cas3 qui clive un brin de l'ADN cible ; les systèmes de types II, utilisent la RNAse III pour séparer les répétitions des transcrits. La protéine Cas9 s'associe avec un fragment de transcrit et, lors de la reconnaissance d'un ADN cible, Cas9 clive les 2 brins de cet ADN ; les systèmes de type III, utilisent la protéine Cas6 pour cliver les transcrits de CRISPR au niveau des épingles, les segments de transcrits obtenus s'associent avec un complexe Cas10. Ce système requiert qu'il y ait transcription de l'ADN cible, le complexe Cas10/spacer clive alors un brin de l'ADN cible (brin non transcrit), ainsi que l'ARN en cours de transcription.

Découverte et commercialisation

Le système CRISPR-Cas9, notamment tel que développé par la chercheuse française Emmanuelle Charpentier sur la base d'une idée qu'elle a eue à Vienne au début des années 2000 (pour lequel elle obtient le prix Nobel) est depuis les années 2010 devenu un outil de génie génétique révolutionnaire permettant de modifier plus facilement et plus précisément les séquences d’ADN, et utilisé pour des thérapies géniques associé à un vecteur souvent viral. .

Il est aussi utilisé pour exprimer des gènes grâce à l'activation CRISPR, entre autres pour reprogrammer des cellules.

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