La chromatographie de partage centrifuge (CPC) est une technique de séparation préparatoire visant à séparer un analyte de sa matrice sans support solide à l’aide de la force centrifuge d’une phase stationnaire et d’une différence de densité entre les phases non-miscibles. Elle sert principalement à la purification de composés naturels. Cette technique de chromatographie présente la particularité de mettre en oeuvre une phase mobile liquide au contact d’une phase stationnaire liquideChromatographie de partage centrifuge - Principes et applications, Karine FAURE, 10 septembre 2016.

Histoire En juin 1941, la Société britannique de biochimie a tenu sa 214 réunion à Londres, à l'Institut national de recherche mMédicale. Lors de cette réunion, deux jeunes chimistes, A.J.P. Martin et R.L.M. Synge, respectivement , ont présenté leur article établissant la séparation ainsi que la détermination des acides monoamino monocarboxyliques présents dans la laine en utilisant une nouvelle méthode. Cette conférence et leurs publications détaillées subséquentes mettent en lumière la naissance de la chromatographie de partage centrifuge. En 1951, soit exactement plus tard, le scientifique Martin et un autre jeune scientifique, âgé de 29 ans A.T. James, ont soumis le manuscrit d’un article majeur décrivant une extension de la chromatographie de partage dans laquelle la phase mobile était un gaz. Cette publication représente la naissance de la chromatographie gaz-liquide (GLPC). 

Les deux scientifiques, soient A.J.P. Martin et R.L.M. Synge, ont tous les deux étudiés au sein de l’Université de Cambridge en Angleterre. Depuis son enfance, Martin a toujours été fasciné par la distillation fractionnelle et a toujours voulu faire génie chimique comme carrière. Cependant, sous l’influence du Professeur, J.B.S. Haldane, ce dernier a étudié en biochimie soit le même programme de Synge. Après leur graduation, soit en 1932 et 1936, Martin rejoint le « Dunn National Laboratory » et conduit des recherches sur la vitamine E. C’est un jour, lors de la conférence du Winterstein du laboratoire de Kuhn en Allemagne, que Martin a très bien reconnu la similitude entre la chromatographie et la théorie de la distillation. Cependant, n’ayant pas poursuivi ce sujet à l’époque, ce dernier mémorisa la démonstration du Winterstein.  

De son côté, Synge étain actif au sein de l’Université de Cambridge, au laboratoire biochimique. En 1938, ce dernier a reçu une bourse offerte par « International Wool Secretariat » (IWS). Il a été proposé à Synge d’étudier en détail la composition en acides aminés de la laine et également d’essayer d’améliorer les méthodes d’analyse des acides aminés. Lors de ces études, le scientifique remarqua qu’il fallait qu’il réalise une extraction liquide-liquide. À cette époque, il a été suggéré à Synge de contacter Martin, qui lui avait beaucoup d’expérience dans le processus d’extraction liquide-liquide.

Les travaux menés par le scientifique Synge cherchaient à réaliser une étude approfondie sur la composition d’acides aminées dans la laine. Cependant, l’appareil de Martin ne convenait pas pour une utilisation avec un système chloroforme-eau. Sur ce, ce dernier, en collaboration avec Synge, conçu une machine complètement différente, maintenant pour l’extraction en continu à contre-courant liquide-liquide, au sein des laboratoires de la « British Wool Industries Research Association » à Leeds au Royaume-Uni. Cependant, cette machine représentait plusieurs problèmes et inconvénients tels la lutte contre la somnolence due à la vapeur de chloroforme, la non-qualification sur la séparation des monoamino-acides monocarboxyliques présents dans la laine, Martin surnomma la machine comme étant un « morceau diabolique d’appareil ».

En 1940, Martin réalisa que le problème était lié à la création d’équilibres dans deux liquides se déplaçant dans la direction opposée. En fait, selon le scientifique, il n’était pas nécessaire de déplacer les deux liquides mais seulement un tout en maintenant l’autre stationnaire dans le tube. Une fois cette solution réalisée, Martin et Synge ont décidé que l’eau devrait servir de phase stationnaire et de chloroforme comme phase mobile. C’était donc la naissance de la chromatographie de partage, aussi connu sous la chromatographie de partage centrifuge.

Théorie

Principe Le but de la technique de la CPC est donc de pouvoir faire une séparation préparatoire liquide-liquide sur colonne sans avoir besoin de support solide. Deux phases liquides immiscibles seront donc utilisées et formeront ainsi le système de solvant, la phase qui restera dans la colonne sera la phase stationnaire et la phase qui portera l’échantillon et qui s’écoulera de la colonne sera la phase mobile ou l’éluant. Les molécules seront séparées selon leurs différences de partage entre les deux phases. L’une des particularités intéressantes de la CPC est de pouvoir utiliser n’importe quel système de solvants immiscibles, mais il est préférable que la différence entre la densité de la phase mobile et la phase stationnaire soit importante pour pouvoir mieux les départager. Le champ centrifuge provoqué par la rotation de la colonne apporte aussi des effets particuliers. Il permet d’aider le partage entre la phase stationnaire et la phase mobile mais aussi de garder la phase stationnaire dans la colonne avec l’aide de la forme spéciale de la colonne et de la différence de densité entre les deux phases.

La phase mobile contenant l’échantillon est alors introduite dans la colonne et elle traversera la phase stationnaire. Il se produit alors des échanges de molécules entre les deux phases il se produit une séparation de l’échantillon entre les deux phasesT. Michel, Nouvelles méthodologies, de fractionnement et d’identification : Application au molécules bioactives de l’argousier (Hippophaë rhamnoides), Université d’Orléans : Institut de Chimie organique et analytique, 2011, . Cette séparation se fait surtout en fonction du coefficient de partage spécifique du composé en fonction des deux solvants. Toutefois, elle dépend aussi des coefficients de transfert de masse, du débit, du champ centrifuge, et de la nature des deux phases. La phase mobile décante donc et le composé A se retrouve dissout dans les deux phases selon : vignette|Exemple de séparation de composés pour une phase mobile plus dense (bleu) que la phase stationnaire (jaune) La phase mobile est insérée avec l'échantillon, points verts, rouges et mauves, qui vont s'éluer dans l'ordre mauve, rouge et vert. Il est possible de remarquer que l'affinité du composé mauve pour la phase mobile est très grande par rapport à celle de la phase stationnaire (Kd petit), alors que pour le composé rouge l'affinité de la phase mobile est du même ordre que l'affinité pour la phase stationnaire (Kd=1) et finalement pour le composé vert, il s'agit du contraire du composé mauve, il a plus d'affinité pour la phase stationnaire et ne sort de la colonne que difficilement (Kd grand).

Donc puisque Kd varie en fonction de la température, nous pouvons déterminer avec ces deux équations et pour une température donnée que

Il est à noter qu’une bonne valeur de Kd se situe habituellement entre 0,5 et 5 tout dépendant des applications. Un Kd trop près de zéro aurait trop d’affinité avec la phase mobile et ne serait jamais retenu par le système, alors que s’il était trop grand, il ne quitterait que difficilement le système. En ayant les Kd des solutés on peut alors déterminer un bon système de solvant pour avoir une bonne séparation. Après un certain temps, la phase mobile passe à une autre cellule et le principe recommence, les deux phases immiscibles sont mélangées et séparées plusieurs fois. La phase mobile traversera ainsi toute la colonne et séparera ses solutés selon leur capacité à rester dans celle-ci. À la fin de la colonne, les fractions éluées des phases mobiles et stationnaires sont récupérées et les solutés seront ainsi purifiés. La CPC peut aussi être utilisée pour atteindre des réactions au-delà de l’équilibre thermodynamique puisque la réaction se passe dans la phase stationnaire alors que les produits sont séparés dans la phase mobile. La production des produits se faisant de manière simultanée avec leur séparation, la réaction inverse est ainsi empêchéeK. Shin Omiya, Y. Kabasawa, K. Yanagidaira, H. Sasaki, M. Muto, T. Okada, Y. Ito, Protein separation by nonsynchronous coil planet centrifuge with aqueous-aqueous polymer phase systems, J. Chromatogram. A, 1005, 2010, .. Plusieurs systèmes de solvants peuvent être utilisés pour procéder à une CPC. Ils s’accompagnent d’une myriade de propriétés particulières, comme la polarité, la présence de réactifs d’extraction, la nature des solvants qui peut être aqueuse, organique, bio-organique ou inorganique. La plupart des systèmes vont aussi être qualifiables pour des fins d’analyse. On peut même utiliser un système de 2 à 5 solvants, surtout pour le fractionnement d’extraits végétaux tel le système Hex/AE/BuOH/MeOH/H2O par Oka et al.F. Oka, H. Oka, Y. Ito, Systematic search for suitable two-phase solvent systems for high-speed counter-current chromatography, Journal of Chromatography A, 538(1), 1991 : 99-108. et bien d’autres. Il n’y a en fait que trois critères à respecter pour avoir un système de solvants : au moins deux phases immiscibles, la phase stationnaire doit être retenue dans la colonne, l’échantillon doit pouvoir être séparé par le système. Si le composé est non-polaire ou instable dans l’eau il est préférable d’avoir deux phases non-aqueuses. Si les molécules sont ionisables, il est possible de rajouter des ions ou des molécules échangeuses dans le système. S’il s’agit de macromolécules ou de particules de cellules un système de polymère en phase aqueuse/aqueuse est l’idéal, ou si elles sont versatiles, deux solutions existent, un système oxyde de polyéthylène (PEO)/phosphate de potassium où il est possible d’ajuster le Kd avec la masse molaire du PEO ou en modifiant le pH ou la concentration du tampon de phosphate. La deuxième possibilité est un système PEO 6000/Dextran 500 qui donne un environnement propice pour la séparation de mammifère tout en optimisant l’osmolarité et le pH avec des électrolytes. Il est aussi possible de faire de la pré concentration et de la séparation d’inorganiques avec la CPC. Pour cela, une phase stationnaire contenant des réactifs échangeurs d’ions dans un solvant organique est une option populaire. Dans ces cas la phase mobile ne doit pas interférer alors des solutions d’acides inorganiques avec leurs sels sont de mise, bien qu’elle pourrait aussi contenir des agents complexant qui iraient se lier à un ou plusieurs solutés lors de la séparationWD. Conway, Counter current Chromatography, Apparatus, Theory and Applications, VCH, Weinheim, 2000.

Fonctionnement