thumb|Kit CDC de diagnostic par RT-PCR transcription inverse suivie d'une amplification en chaîne par polymérase pour le Coronavirus 2019-nCoV, rebaptisé SARS-CoV-2. thumb|Écouvillons stériles pour prélèvements à fin de recherche du coronavirus SARS-CoV-2 en laboratoire.
Un test diagnostique du SARS-CoV-2 peut être effectué en cas de suspicion de maladie à coronavirus 2019 (Covid-19) à l'examen clinique et en complément à des examens approfondis (tomodensitométrie, etc.). Il peut être effectué par des tests de réaction en chaîne par polymérase après transcriptase inverse pour la détection de l'ARN viral (RT-PCR, pour « reverse transcription - polymerase chain reaction ») ou par des tests à base d'anticorps ELISA pour la détection des protéines du virion.
L'infrastructure de recherche européenne EVA (European Virus Archive) s'est rapidement organisée pour fournir aux laboratoires de diagnostic du monde entier des éléments viraux destinés à servir de contrôle pour les tests fondés sur l'ARN ou sur la protéine..
Types de tests RT-PCR (ou par biologie moléculaire, détection de gènes) Historique de la méthode PCR La méthode PCR - l’amplification en chaîne par polymérase (ACP), ou réaction de polymérisation en chaîne (ou PCR en anglais) - est une méthode de biologie moléculaire d'amplification génique in vitro. Cette méthode PCR est inventée, en 1983, par Kary Mullis alors chercheur dans la synthèse des oligonucléotides au sein de Cetus Corporation, petite entreprise de biotechnologies californienne. Officiellement reconnu comme père de la PCR, il reçoit en 1993, à , le prix Nobel de chimie, « pour sa contribution au développement des méthodes pour la chimie de l'ADN et pour son invention de la PCR »https://www.industrie-techno.com/article/1983-il-invente-la-pcr.16884. Au début des années 1990 la PCR évolue avec l'invention de la PCR en temps réel par Russell Higuchi et de la Q-PCR (Quantitative polymerase chain reaction) qui permet de réaliser des mesures quantitatives.
PCR pour la Covid-19 L'un des premiers tests par RT-PCR, est développé à La Charité à Berlin en en utilisant la PCR quantitative et a formé la base de que l'OMS distribue.. Le , l'OMS diffuse un protocole-type établi par l'institut Pasteur de Paris.. D'après une étude coréenne, ce dernier test aurait une sensibilité inférieure à la détection du gène N..
La sensibilité de ce type de test est évaluée de 50 à 60 % et la spécificité est assez mauvaise à 75 %, contre 99 % et 98 % pour les tests PCR multiplex., qui ne sont pas encore utilisés au début du mois de .
La société sud-coréenne Kogenebiotech Kogenebiotech. a annoncé le . que son kit de détection PowerChek 2019-nCoV Real-time PCR Kit, qui cible le gène « E » partagé par tous les betacoronavirus et le gène RdRp spécifique du SARS-CoV-2., avait reçu une de la part des autorités coréennes et américaines.
D'autres sociétés comme Seegene Seegene - Site officiel. et Solgent Solgent - Site officiel. ont également développé en leurs versions de kits de détection de qualité clinique appelés « DiaPlexQ » et « Allplex 2019-nCoV Assay » respectivement.
Aux États-Unis, les distribuent le test de diagnostic CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR aux laboratoires de santé publique.. Dans les premières versions, un test génétique sur trois avait donné des résultats non concluants au CDC d'Atlanta ; les tests plus récents utilisant deux composants ont été jugés fiables le , permettant aux laboratoires nationaux et locaux d'accomplir rapidement les tests. : ce test a été approuvé par la (FDA) en vertu d'une autorisation d'utilisation en urgence.
L'université des sciences et technologies de Hong Kong a proposé début février un test RT-PCR microfluidique très rapide..
Au , l' a répertorié les laboratoires de référence officiels et les protocoles de développement suivants. : Pays Institut Cibles génétiques Charité RdRp, E, N CDC chinois ORF 1ab et nucléoprotéine (N) CDC américain Trois cibles dans le gène N Institut Pasteur, Paris Deux cibles dans le gène RdRp, E HKU ORF1b-nsp14, N Institut national des maladies infectieuses Protéine (Péplomère) Institut national de la santé N
Le , l'OMS publie la liste des tests RT-PCR utilisables en cas d'urgence : il s'agit des tests de Primerdesign, division de Novacyt, Grande-Bretagne, et cobas SARS-CoV-2 utilisable sur , de Roche, États-Unis.. Cette liste est ensuite complétée pour atteindre fin ..
Production des kits de test RT-PCR Dès le mois de janvier, tous les fabricants potentiels se sont lancés dans une bataille pour produire les kits de tests RT-PCR : lutte contre le temps pour juguler l'épidémie et lutte commerciale pour ne pas rester à l'écart d'une demande explosive.
Au , le site . recense plus de destinés au diagnostic du SARS-CoV-2, dont 428 commercialisés et 85 en développement. Dans les tests commercialisés, 223 sont des tests virologiques, essentiellement selon la méthode RT-PCR.
Pour la France, le ministère de la Santé publie la liste des réactifs de diagnostic par RT-PCR du SARS-CoV-2.. À la date du , cette liste recense validés par le CNR (Centre national de référence) et marqués CE.
La disponibilité effective des réactifs est un point critique dans la politique de dépistage mise en place dans chaque pays. En mars et avril, il y a peu d'informations sur les nombres de kits de test disponibles, soit du côté des fabricants : capacité de production et quantité produite, soit du côté des pays : quantité commandée, quantité livrée et quantité utilisée.
En plus des kits de réactifs nécessaires, il faut aussi disposer de kits de prélèvement. Bien qu'ils soient beaucoup plus simples à fabriquer, les médias ont rapporté des pénuries de kits de prélèvement dans certains pays.
Fiabilité des tests RT-PCR vignette|Document du résultat du test antigénique rhino pharyngé COVID-19 remis au patient (). La fiabilité des tests RT-PCR fut souvent mise en doute. Cette mauvaise fiabilité apparente recouvre plusieurs sujets, les uns liés à l'analyse RT-PCR, d'autres liés à l'évolution de la maladie chez un patient, d'autres enfin liés aux procédures de mise en œuvre.
Concernant la méthode RT-PCR, c'est une méthode qui pour certains n'aurait pas intrinsèquement une excellente fiabilité. En effet, il y a, par exemple, pour le Sars-Cov2 de nombreuses et constantes mutations du virus, qui peuvent le rendre moins détectable. Pour certains, la sensibilité serait mauvaise. (la plus faible en moyenne parmi tous les types de tests), la spécificité (la capacité à détecter le virus recherché et pas autre chose) assez bonne. Pour d'autres, les tests remonteraient beaucoup trop de faux positifs à cause d'une valeur utilisée du Ct () trop élevée, et ne donneraient pas d'indication sur la contagiosité, contrairement aux tests quantitatifs RT-PCR...... On a par ailleurs constaté aussi des défaillances dans les procédures et les réactifs destinés au diagnostic du SARS-CoV-2. En , le CDC des États-Unis a décidé de ne pas utiliser les tests mis au point internationalement et de développer son propre test qui s'est révélé défectueux ; en mars et avril, des millions de kits livrés par la Chine se sont révélés défectueux en Espagne, République tchèque, Slovaquie, Turquie et Royaume-Uni.
En France, la validation de chaque kit de réactifs est réalisé par le Centre national de référence (CNR) grâce à une souche virale unique et en utilisant la procédure et l'équipement d'analyse spécifiés par le fabricant.
Sources de faux positifs apparents ou réels :
réactifs ou procédure incorrecte ou mauvaise sélectivité : le test détecte autre chose que le SARS-CoV-2 ; contamination croisée durant le prélèvement ou durant l'analyse ; erreur d'identification du patient, notamment lorsque la procédure n'assure pas une traçabilité automatique par code barre depuis le prélèvement jusqu'à la délivrance du résultat.
Source de faux négatifs apparents ou réels :
réactifs ou procédure incorrecte ; le test ne détecte pas suffisamment le SARS-CoV-2 ; mutation du virus ; certains réactifs pourraient être mis en défaut ; c'est théoriquement possible, mais pas encore signalé pour le SARS-CoV-2 ; mauvais prélèvement ; le virus est présent, mais le prélèvement a récolté trop peu de virus ; en particulier, on a vu des cas où le prélèvement est réalisé par le patient, ce qui risque d'être insuffisant, car le prélèvement est très désagréable ; début de l'infection ; la charge virale est encore faible ; évolution de l'infection (le cas le plus fréquent) ; après quelques jours de symptômes, la charge virale dans les voies respiratoires supérieures a fortement diminué, bien que le virus soit présent dans l'organisme. Il faut faire des prélèvements dans les voies respiratoires basses, ou dans les selles. C'est la principale cause de « faux négatifs ». Techniquement, il ne s'agit pas d'un faux négatif, car il n'y a plus de virus présent, mais médicalement, le test étant négatif et la maladie présente, on peut l'appeler faux négatif. Cette précision subtile permet de comprendre les discordances importantes sur les taux de sensibilité rapportés ; erreur d'identification du patient ; erreur du système informatique ; par exemple, l'Irlande a rapporté la situation où des tests revenus avec le statut ont été classés parce que le logiciel utilisé ne connaissait que ..
Pour la recherche : l'analyse RT-PCR est une méthode de référence pour les recherches sur le coronavirus, par exemple pour l'étude de la persistance. Dans ce contexte, elle présente un défaut sérieux ; l'analyse RT-PCR permet de détecter des traces même très faibles de l'ARN du coronavirus, mais elle ne prouve pas que l'on est en présence de virions capables d'infecter une cellule. C'est une source de controverses sur certaines études publiées.
Organisation pratique des tests RT-PCR
vignette|Test PCR de dépistage du SARS-CoV-2 par prélèvement nasal à Strasbourg le . Les tests PCR sont bien connus et couramment utilisés pour rechercher des virus humains, animaux ou végétaux. Toutefois, la méthode est assez sophistiquée et n'est pas disponible dans les laboratoires de ville ou les hôpitaux simples. L'organisation actuelle pour la réalisation des tests PCR est fondée sur des plateaux techniques disposant des installations et des machines d'analyse ; ces plateaux techniques existent dans des laboratoires publics associés aux CHU ou dans des laboratoires privés qui fédèrent quelques dizaines ou quelques centaines de laboratoires de ville. En France, il y a environ techniques équipés face aux de biologie médicale (source INSEE).
Le déroulement d'un test RT-PCR pour diagnostic du SARS-CoV-2 se fait en quatre phases :
Prélèvement - Identification du patient, prélèvement nasopharyngé avec un écouvillon (à ne pas confondre avec le prélèvement nasal, moins profond, utilisé pour certains tests antigéniques.) ou prélèvement oropharyngé avec un écouvillon par la bouche jusqu’à l’arrière-gorge (oropharynx). ou prélèvement salivaire au moins après avoir mangé et bu (en crachant dans un tube ou prélevé sous la langue soit en plaçant un écouvillon pendant une minute, soit avec une pipette).., puis conditionnement de l'échantillon sous triple emballage. Ce prélèvement peut être fait par les laboratoires de ville, les services des hôpitaux, ou même les médecins de ville, à condition de disposer du kit de prélèvement. Certaines procédures prévoient de prendre deux échantillons pour chaque prélèvement. Durée : . À partir de la mi-, on autorise des prélèvements par la salive mais ceux-ci sont en 2021 limités à des contextes très précis : milieux-scolaires ou médicalisés et assez peu diffusés devant la réticence des laboratoires..