Une banque génomique est une collection de l'ADN génomique total d'un seul organisme.
L'ADN est stocké dans une population de vecteurs identiques, chacun contenant un insert d'ADN différent. Afin de construire une banque génomique, l'ADN de l'organisme est extrait des cellules puis digéré par une enzyme de restriction pour couper l'ADN en fragments d'une taille spécifique. Les fragments sont ensuite insérés dans le vecteur à l'aide de la ligase. Ensuite, le vecteur d'ADN peut être absorbé par un organisme hôte - généralement une population d'Escherichia coli ou de levure -, chaque cellule ne contenant qu'une seule molécule de vecteur. L'utilisation d'une cellule hôte pour transporter le vecteur permet de faciliter l'amplification et la récupération de clones spécifiques de la banque pour analyse.
Il existe plusieurs types de vecteurs avec différentes capacités d'insert. Généralement, les banques faites à partir d'organismes avec des génomes plus grands nécessitent des vecteurs comportant des inserts plus grands, donc moins de molécules vectorielles sont nécessaires pour constituer la banque. Les chercheurs peuvent choisir un vecteur en considérant également la taille idéale de l'insert afin de trouver le nombre souhaité de clones nécessaires pour avoir une couverture complète du génome. Les banques génomiques sont couramment utilisées pour le séquençage de régions génomiques. Elles ont joué un rôle important dans le séquençage du génome entier de plusieurs organismes, y compris du génome humain et de plusieurs organismes modèles.
Histoire Le premier génome basé sur l'ADN entièrement séquencé a été réalisé par le double lauréat du prix Nobel, Frederick Sanger en 1977. Sanger et son équipe de scientifiques ont créé une banque du bactériophage phi X 174 pour une utilisation dans le séquençage de l'ADN. L'importance de ce succès a contribué à la demande toujours croissante de séquençage des génomes pour la recherche sur la thérapie génique. Les équipes sont désormais en mesure de cataloguer les polymorphismes dans les génomes et d'étudier les gènes candidats contribuant à des maladies telles que la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, la sclérose en plaques, la polyarthrite rhumatoïde et le diabète de type 1. Celles-ci sont dues à l'avancée des études d'association à l'échelle du génome à partir de la capacité à créer et à séquencer des banques génomiques. Des études préalables, de liaison et de gènes candidats constituaient quelques-unes des seules approches.
Construction d'une banque génomique La construction d'une banque génomique implique la création de nombreuses molécules d'ADN recombinant. L'ADN génomique d'un organisme est extrait puis digéré par une enzyme de restriction. Pour les organismes à très petits génomes (environ 10 kb), les fragments digérés peuvent être séparés par électrophorèse sur gel. Les fragments séparés peuvent ensuite être excisés et clonés séparément dans le vecteur. Cependant, lorsqu'un génome de grande taille est digéré par une enzyme de restriction, il y a beaucoup trop de fragments pour les exciser individuellement. L'ensemble complet des fragments doit alors être cloné avec le vecteur, et à ce moment-là on peut séparer les clones. Dans les deux cas, les fragments sont ligaturés dans un vecteur qui a été digéré avec la même enzyme de restriction. Le vecteur contenant les fragments d'ADN génomique insérés peut ensuite être introduit dans un organisme hôte.
Voici les étapes de création d'une banque génomique à partir d'un grand génome : Extraction et purification de l'ADN ; Digestion de l'ADN avec une enzyme de restriction ; cela crée des fragments de taille statistiquement homogène ; Insertion des fragments d'ADN dans des vecteurs qui ont été coupés avec la même enzyme de restriction ; on utilise une enzyme, l'ADN ligase, pour lier les extrémités des fragments d'ADN à celles du vecteur, et former des molécules recombinantes circulaires ; Absorption de ces molécules recombinantes par une bactérie-hôte par transformation, créant la banque d'ADN proprement dite.
Voici un diagramme des étapes décrites ci-dessus. vignette|Construction d'une banque génomique. Détermination du titre de la banque Après qu'une banque génomique ait été construite avec un vecteur viral, tel qu'un phage lambda, le titre de la banque peut être déterminé. Le calcul du titre permet aux chercheurs d'estimer le nombre de particules virales infectieuses qui ont été créées avec succès dans la banque. Pour ce faire, des dilutions de la banque sont utilisées pour transformer des cultures d' E. coli de concentrations connues. Les cultures sont ensuite étalées sur des plaques d'agar et incubées pendant une nuit. Le nombre de plaques virales est compté et peut être utilisé pour calculer le nombre total de particules virales infectieuses dans la banque. La plupart des vecteurs viraux portent également un marqueur qui permet de distinguer les clones contenant un insert de ceux qui n'ont pas d'insert. Cela permet aux chercheurs de déterminer également le pourcentage de particules virales infectieuses portant réellement un fragment de la banque.
Une méthode similaire peut être utilisée pour titrer les banques génomiques faites avec des vecteurs non viraux, tels que les plasmides et les BAC. Un test de ligature de la banque peut être utilisé pour transformer E. coli. La transformation est ensuite étalée sur des plaques de gélose et incubée pendant une nuit. Le titre de la transformation est déterminé en comptant le nombre de colonies présentes sur les plaques. Ces vecteurs ont généralement un marqueur sélectionnable permettant la différenciation des clones contenant un insert de ceux qui n'en contiennent pas. En faisant ce test, les chercheurs peuvent également déterminer l'efficacité de la ligature et effectuer les ajustements nécessaires pour s'assurer qu'ils obtiennent le nombre souhaité de clones pour la banque.
Criblage d'une banque vignette|Hybridation par transfert de colonies Afin d'isoler des clones qui contiennent des régions d'intérêt d'une banque, celle-ci doit d'abord être filtrée. Une méthode de criblage est l'hybridation, dans laquelle chaque cellule hôte transformée d'une banque ne contiendra qu'un seul vecteur avec un insert d'ADN. Toute la banque peut être plaquée sur un filtre sur support. Le filtre et les colonies sont préparés pour l'hybridation puis marqués avec une sonde. L'ADN-cible (l'insert d'intérêt) peut être identifié par détection, par exemple en autoradiographie, en raison de l'hybridation avec la sonde comme indiqué ci-dessous.
Une autre méthode de criblage est la réaction en chaîne par polymérase (PCR). Certaines banques sont stockées sous forme de « pools » de clones et le criblage par PCR est un moyen efficace d'identifier les pools contenant des clones spécifiques.
Types de vecteurs La taille du génome varie selon les différents organismes et le vecteur de clonage doit être sélectionné en conséquence. Pour un grand génome, un vecteur de grande capacité doit être choisi de manière qu'un nombre relativement petit de clones soit suffisant pour couvrir l'ensemble du génome. Cependant, il est souvent plus difficile de caractériser un insert contenu dans un vecteur de plus grande capacité que dans des plus petits.
Ci-dessous un tableau de plusieurs types de vecteurs couramment utilisés pour les banques génomiques et la taille de l'insert que chacun contient généralement : Type de vecteur Taille de l'insert (milliers de bases) Plasmide jusqu'à 10 Phage lambda (λ) jusqu'à 25 Cosmide jusqu'à 45 Bactériophage P1 70 à 100 Chromosome artificiel P1 (PAC) 130 à 150 Chromosome artificiel bactériens (BAC) 120 à 300 Chromosome artificiel de levure (YAC) 250 à
Plasmides Un plasmide est une molécule d'ADN circulaire double brin couramment utilisée pour le clonage moléculaire. Les plasmides ont généralement une longueur de 2 à et sont capables de porter des inserts jusqu'à . Les plasmides contiennent une origine de réplication leur permettant de se répliquer à l'intérieur d'une bactérie indépendamment du chromosome hôte. Les plasmides portent généralement un gène de résistance aux antibiotiques qui permet la sélection de cellules bactériennes contenant le plasmide. De nombreux plasmides portent également un gène rapporteur qui permet aux chercheurs de distinguer les clones contenant un insert de ceux qui n'en contiennent pas.
Phage lambda (λ) Le phage λ est un virus à ADN double brin qui infecte E. coli. Le chromosome λ mesure 48,5 kb de long et peut porter des inserts jusqu'à 25 kb. Ces inserts remplacent les séquences virales non essentielles du chromosome λ, tandis que les gènes nécessaires à la formation de particules virales et à l'infection restent intacts. L'ADN inséré est répliqué avec l'ADN viral ; ainsi, ensemble, ils sont encapsidés en particules virales. Ces particules sont très efficaces pour l'infection et la multiplication, conduisant ainsi à une production plus élevée de chromosomes λ recombinants. Cependant, en raison de la taille plus petite de l'insert, les banques faites avec le phage λ peuvent nécessiter de nombreux clones pour une couverture complète du génome.
Cosmides Les cosmides sont des plasmides qui contiennent une petite région d'ADN du bactériophage λ appelée séquence cos. Cette séquence permet au cosmide d'être conditionné en particules de bactériophage λ. Ces particules, contenant un cosmide linéarisé, sont introduites dans la cellule hôte par transduction. Une fois à l'intérieur de l'hôte, les cosmides circulent à l'aide de l'ADN ligase de l'hôte, puis fonctionnent comme des plasmides. Les cosmides sont capables de transporter des inserts jusqu'à 40 kb.
Vecteurs de bactériophage P1 Les vecteurs du bactériophage P1 peuvent contenir des inserts de 70 à 100 kb. Ce sont au départ des molécules d'ADN linéaires encapsidées dans des particules de bactériophage P1. Ces particules sont injectées dans une souche d' E. coli exprimant la recombinase CRE. Le vecteur P1 linéaire devient alors circularisé par recombinaison entre deux sites loxP dans le vecteur. Les vecteurs P1 contiennent généralement un gène de résistance aux antibiotiques et un marqueur de sélection positive pour distinguer les clones contenant un insert de ceux qui n'en contiennent pas. Les vecteurs P1 contiennent également un réplicon de plasmide P1, qui garantit qu'une seule copie du vecteur est présente dans une cellule. Cependant, il existe un deuxième réplicon P1 - appelé réplicon lytique P1 - qui est contrôlé par un promoteur inductible. Ce promoteur permet l'amplification de plus d'une copie du vecteur par cellule avant l'extraction de l'ADN. droite|vignette|400x400px| Vecteur BAC
Chromosomes artificiels P1 Les chromosomes artificiels P1 (PAC) possèdent des caractéristiques à la fois des vecteurs P1 et des chromosomes artificiels bactériens (BAC). Semblables aux vecteurs P1, ils contiennent un plasmide et un réplicon lytique comme décrit ci-dessus. Mais contrairement aux vecteurs P1, ils n'ont pas besoin d'être encapsidés dans des particules de bactériophage pour la transduction. Au lieu de cela, ils sont introduits dans E. coli sous forme de molécules d'ADN circulaires par électroporation, tout comme les BAC. Également similaires aux BAC, ils sont relativement plus difficiles à préparer en raison du fait qu'ils n'ont qu'une seule origine de réplication.
Chromosomes artificiels bactériens