Variantes de la PCR

La polyvalence de la réaction en chaîne par polymérase (PCR) a conduit au développement d'un grand nombre de variantes de la PCR.

Modifications de la méthode de base Souvent, seule une petite modification doit être apportée au protocole de la PCR standard pour atteindre l'objectif souhaité.

La PCR multiplexe utilise plusieurs paires d'amorces s'hybridant à différentes séquences cibles. Cela permet l'analyse simultanée de plusieurs cibles dans un seul échantillon. Par exemple, lors de tests de mutations génétiques, six amplifications ou plus peuvent être combinées. Dans le protocole standard pour les empreintes digitales d'ADN, les cibles testées sont souvent amplifiées en groupes de 3 ou 4. Lamplification de sonde dépendante de la ligature multiplex (ou MLPA) permet à plusieurs cibles d'être amplifiées en utilisant uniquement une seule paire d'amorces, ce qui évite les limitations de résolution de la PCR multiplexe. La PCR multiplexe a également été utilisée pour l'analyse des microsatellites et des SNP. droite|vignette|200x200px| Variations des longueurs VNTR (répétitions en tandem) chez 6 individus. La PCR des nombres variables de répétitions en tandem (VNTR) cible les zones du génome qui présentent une longueur variable. L'analyse des génotypes de l'échantillon implique généralement le dimensionnement des produits d'amplification par électrophorèse sur gel. L'analyse de segments VNTR plus petits connus sous le nom de répétitions tandem courtes (ou STR) constitue le socle des bases de données d'empreintes digitales d'ADN telles que CODIS .

La PCR asymétrique amplifie préférentiellement un brin de l'ADN cible. Il est utilisé dans certaines méthodes de séquençage et chez les sondes d'hybridation, pour générer un brin d'ADN comme produit. Le thermocyclage est effectué comme en PCR classique, mais avec une quantité limitante d'amorces ou en en laissant une de côté. Lorsque l'amorce limitante devient épuisée, la réplication augmente de façon arithmétique par extension de l'amorce en excès. Une modification de ce processus, nommée Linear-After-The-Exponential-PCR (ou LATE-PCR pour PCR tardive, litt.), utilise une amorce limitante ayant une température de fusion (Tm) plus élevée que l'amorce en excès, afin de maintenir l'efficacité de la réaction parce que la concentration d'amorce limitante diminue à mi-réaction. (Voir également PCR de chevauchement-extension ou overlap-extension PCR en anglais.)

Certaines modifications sont nécessaires pour effectuer ce qu'on appelle une longue PCR. Le processus de PCR original basé sur fragments de Klenow n'a pas réussi à générer de produits supérieurs à environ 400 pb. La Taq polymérase peut cependant amplifier des cibles pouvant atteindre plusieurs milliers de pb (kb) de long. Depuis lors, des protocoles modifiés avec l'enzyme Taq ont permis d'amplifier des cibles de plus de 50 kb. droite|vignette|253x253px| PCR imbriquée (nested PCR en anglais). La PCR imbriquée est utilisée pour augmenter la spécificité de l'amplification de l'ADN. Deux jeux d'amorces sont utilisés dans deux réactions successives. Dans la première PCR, une paire d'amorces est utilisée pour générer des produits d'ADN, qui peuvent contenir des produits amplifiés à partir de zones non cibles. Les produits de la première PCR sont ensuite utilisés comme modèle dans une deuxième PCR, en utilisant une amorce (« hémi-imbrication ») ou deux amorces différentes dont les sites de liaison sont localisés (imbriqués) dans le premier ensemble, augmentant ainsi la spécificité. La PCR imbriquée réussit souvent mieux à amplifier spécifiquement les produits d'ADN longs que la PCR conventionnelle, mais elle nécessite une connaissance plus détaillée de la séquence de la cible.

La PCR quantitative (ou qPCR) est utilisée pour mesurer la quantité spécifique d'ADN (ou ARN) cible dans un échantillon. En mesurant l'amplification uniquement dans la phase d'augmentation exponentielle réelle, la quantité de produit mesuré reflète plus précisément la quantité initiale de cible. Des thermocycleurs (machines à PCR) spéciaux sont utilisés pour surveiller la quantité de produit généré pendant l'amplification. Les méthodes de PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) utilisent des fluorochromes, tels que le SybrGreen, ou des sondes d'ADN contenant un fluorochrome, telles que TaqMan, pour mesurer la quantité de produit amplifié à mesure que la réaction progresse.

La PCR à démarrage à chaud (hot-start PCR) est une technique effectuée manuellement en chauffant les composants de la réaction à la température de fusion de l'ADN (par exemple 95 °C) avant d'ajouter la polymérase. De cette façon, on évite une amplification non spécifique à des températures plus basses. Alternativement, des réactifs spécialisés inhibent l'activité de la polymérase à température ambiante, soit par la liaison d'un anticorps, soit par la présence d'inhibiteurs liés de façon covalente qui ne se dissocient qu'après une étape d'activation à haute température. La « PCR à démarrage à chaud/finition à froid » (« hot-start/cold-finish PCR ») est obtenue avec de nouvelles polymérases hybrides qui sont inactives à température ambiante et ne sont activées qu'à des températures élevées.

Dans la PCR par essais (touchdown PCR), la température d'hybridation diminue progressivement au cours des cycles ultérieurs. La température d'hybridation dans les premiers cycles est généralement de 3 à 5 °C au-dessus de la norme Tm des amorces utilisées, tandis que dans les cycles ultérieurs, elle est de 3 à 5 °C en-dessous de la Tm. La température d'hybridation initiale plus élevée conduit à une plus grande spécificité pour la liaison des amorces, tandis que les températures plus basses permettent une amplification plus efficace à la fin de la réaction.

La PCR assemblée (assembly PCR, également connue sous le nom de Polymerase Cycling Assembly ou PCA) consiste à synthétiser de longues structures d'ADN en effectuant la PCR sur un pool d'oligonucléotides longs avec de courts segments se chevauchant, pour assembler deux ou plusieurs morceaux d'ADN en un seul morceau. Elle implique une PCR initiale avec des amorces qui se chevauchent et une seconde PCR utilisant les produits comme modèle permettant de générer le produit final de pleine longueur. Cette technique peut remplacer l'assemblage basé sur la ligature.

Dans la PCR coloniale (colony PCR), des colonies bactériennes sont criblées directement par PCR, par exemple lors du criblage pour obtenir des constructions de vecteurs d'ADN correctes. Les colonies sont échantillonnées avec une pointe de pipette stérile et une petite quantité de cellules est transférée dans un mélange pour PCR. Pour libérer l'ADN des cellules, la PCR est soit démarrée avec un temps prolongé à 95 °C (lorsque la polymérase standard est utilisée), ou avec une étape de dénaturation raccourcie à 100 °C et une ADN polymérase chimérique spéciale.

La PCR digitale ( ou dPCR) permet d'amplifier simultanément des milliers d'échantillons, chacun isolé dans une gouttelette distincte au sein d'une émulsion.

La PCR suicide (suicide PCR) est généralement utilisée en paléogénétique ou dans d'autres études pour lesquelles éviter les faux positifs et garantir la spécificité du fragment amplifié est la plus haute priorité. Elle a été initialement décrite dans une étude visant à vérifier la présence de la bactérie Yersinia pestis dans des échantillons dentaires provenant de tombes du XIVe siècle de personnes qui auraient été tuées par la peste pendant l'épidémie médiévale de la peste noire. La méthode prescrit l'utilisation de toute combinaison d'amorces une seule fois dans une PCR (d'où le terme « suicide »), qui n'aurait jamais dû être utilisée dans une réaction de PCR de contrôle positif, et les amorces doivent toujours cibler une région génomique jamais amplifiée auparavant dans le laboratoire utilisant ce ou tout autre ensemble d'amorces. Cela garantit qu'aucun ADN contaminant des réactions de PCR précédentes n'est présent dans le laboratoire, ce qui pourrait sinon générer des faux positifs.

La COLD-PCR (litt. « PCR à froid », acronyme de co-amplification at lower denaturation temperature-PCR, en français PCR de co-amplification à faible température de dénaturation) est un protocole modifié de PCR qui enrichit les variants alléliques d'un mélange de type sauvage ainsi que l'ADN contenant la mutation d'intérêt.

Prétraitements et extensions Le processus de base de la PCR peut parfois précéder ou suivre une autre technique de biologie moléculaire.

La RT-PCR (pour Reverse Transcription PCR ou PCR à transcriptase inverse en français) est utilisée pour la transcription inverse et l'amplification de l'ARN en ADNc. La PCR est précédée d'une réaction utilisant la transcriptase inverse, une enzyme issue des virus qui convertit l'ARN en ADNc. Les deux réactions peuvent être combinées dans un tube, l'étape de chauffage initiale de la PCR étant utilisée pour inactiver la transcriptase. La polymérase Tth (décrite plus bas) a une activité rétrotranscriptase et peut effectuer toute la réaction. La RT-PCR est largement utilisée dans le profilage d'expression, qui permet de détecter le niveau d'expression d'un gène. Il peut également être utilisé pour obtenir la séquence d'un transcrit d'ARN, ce qui peut aider à la détermination des sites de début et de fin de transcription (par RACE-PCR) et faciliter la cartographie de l'emplacement des exons et des introns dans une séquence de gènes.

La PCR bilatérale (two-tailed PCR) utilise une seule amorce qui se lie à une cible de micro-ARN avec à la fois les extrémités 3' et 5', appelées hémi-sondes. Les deux extrémités doivent être complémentaires pour que la liaison se produise. L'extrémité 3' est ensuite étendue par la transcriptase inverse, ce qui forme un long ADNc. L'ADNc est ensuite amplifié en utilisant deux amorces de PCR spécifiques à la cible. La combinaison de deux hémi-sondes, ciblant toutes deux la courte cible de micro-ARN, rend la PCR bilatérale extrêmement sensible et spécifique.

La PCR médiée par ligature (ligation-mediated PCR) utilise de petits « linkers » (ou adaptateurs) d'oligonucléotides d'ADN qui sont d'abord ligaturés à des fragments de l'ADN cible. Les amorces de PCR qui s'hybrident aux séquences de liaison sont ensuite utilisées pour amplifier les fragments cibles. Cette méthode est déployée pour le séquençage de l'ADN, l'arpentage chromosomique et le footprinting de l'ADN. Une technique apparentée est le polymorphisme de longueur des fragments amplifiés (AFLP), qui génère des fragments de diagnostic d'un génome.

La PCR spécifique à la méthylation (MSP-PCR) est utilisée pour identifier les modèles de méthylation de l'ADN au niveau des îlots de cytosine-guanine (CpG) dans l'ADN génomique. L'ADN cible est d'abord traité avec du bisulfite de sodium, qui convertit les bases de cytosine non méthylées en uracile, qui est complémentaire de l'adénosine dans les amorces de PCR. Deux amplifications sont ensuite effectuées sur l'ADN traité au bisulfite : un ensemble d'amorces est hybridé à l'ADN avec des cytosines (correspondant à la partie des cytosines méthylées), et l'autre ensemble est hybridé à l'ADN avec l'uracile (correspondant à la partie des cytosines non méthylées). La MSP utilisée en qPCR fournit des informations quantitatives sur l'état de méthylation d'un dinucléotide CpG donné.

Autres modifications Les ajustements dans les composants de la PCR sont couramment utilisés pour optimiser les performances.

L'ion magnésium divalent (Mg2+) est requis pour l'activité de la polymérase pendant la PCR. Des concentrations plus faibles en Mg2+ augmenteront la fidélité de réplication, tandis que des concentrations plus élevées introduiront plus de mutations.