vignette|Un chémostat classique avec son affluent ("feed") et son effluent. vignette| Récipient chémostatique fermé avec flux de milieu de culture entrant continu et régulable, ainsi que flux sortant, utilisé pour une culture contrôlée de micro-organismes. Le système maintient un volume et un niveau d'aération constants. Le taux de croissance du micro-organisme est contrôlé par la modification de l'afflux de milieu frais, tandis que la densité de population est régulée en modifiant la concentration en nutriment limitant. Ce système ouvert permet aux chercheurs de maintenir les cellules en phase de croissance exponentielle pour une application dans des expériences s'intéressant à l'état physiologique des cellules. Un chémostat (contraction de "environnement chimique qui reste statique") est un bioréacteur dans lequel du milieu frais est ajouté en continu, tandis que le liquide de culture contenant les nutriments restants, les produits finaux métaboliques et les micro-organismes est éliminé en continu à la même vitesse pour maintenir le volume de culture constant. En modifiant la vitesse à laquelle le milieu est ajouté au bioréacteur, la vitesse de croissance spécifique du micro-organisme peut être facilement contrôlée dans certaines limites.
Fonctionnement
Régime permanent L'une des caractéristiques les plus importantes des chémostats est que les micro-organismes peuvent y être cultivés dans un état physiologique stable en conditions environnementales constantes. Dans cet état d'équilibre, la croissance se produit à un taux de croissance spécifique constant et tous les paramètres de culture restent constants (volume de culture, concentration en oxygène dissous, concentrations en nutriments et en produits, pH, densité cellulaire, etc). De plus, les conditions environnementales peuvent être contrôlées par l'expérimentateur. Les micro-organismes qui se développent dans les chémostats atteignent généralement un état d'équilibre en raison d'une rétroaction négative entre le taux de croissance et la consommation de nutriments : si un faible nombre de cellules sont présentes dans le bioréacteur, les cellules peuvent croître à des taux de croissance supérieurs au taux de dilution car elles consomment peu de nutriments. La croissance est donc moins limitée par l'ajout d'un nutriment limitant dans le milieu frais entrant. Le nutriment limitant est un nutriment essentiel à la croissance, présent dans le milieu à une concentration limite (tous les autres nutriments sont généralement apportés en excédent). Cependant, plus le nombre de cellules augmente, plus le nutriment est consommé, ce qui diminue la concentration du nutriment limitant. À son tour, cela réduira le taux de croissance spécifique des cellules, ce qui entraînera une diminution du nombre de cellules à mesure qu'elles continueront d'être retirées du système avec l'écoulement. Il en résulte un "état d'équilibre", ou régime permanent (steady state en anglais). En raison de l'autorégulation, l'état stationnaire est stable. Cela permet à l'expérimentateur de contrôler le taux de croissance spécifique des micro-organismes en modifiant la vitesse de la pompe alimentant le milieu frais dans le récipient.
Homogénéité Une autre caractéristique importante des chémostats et autres systèmes de culture continue est qu'ils sont bien mélangés, de sorte que les conditions environnementales soient homogènes ou uniformes et que les micro-organismes soient dispersés au hasard et se rencontrent au hasard. Par conséquent, la compétition et les autres interactions dans le chémostat sont globales et non locales, contrairement aux biofilms.
Taux de dilution Le taux d'échange de nutriments est exprimé comme le taux de dilution D. À l'état d'équilibre, le taux de croissance spécifique μ du micro-organisme est égal au taux de dilution D. Le taux de dilution est défini comme le débit de milieu par unité de temps F, sur le volume V de culture dans le bioréacteur.
Taux de croissance maximal et taux de dilution critique Le taux de croissance spécifique μ est inversement proportionnel au temps nécessaire à la biomasse pour doubler, appelé temps de doublement td :
Par conséquent, le temps de doublement td devient une fonction du taux de dilution D en régime permanent :
Chaque micro-organisme poussant sur un substrat particulier a un taux de croissance spécifique maximal μmax (le taux de croissance observé si la croissance est limitée par des contraintes internes plutôt que par des nutriments externes). Si un taux de dilution supérieur à μmax est choisi, les cellules ne peuvent pas croître à une vitesse aussi rapide que la vitesse à laquelle elles sont retirées, de sorte que la culture ne pourra pas se maintenir dans le bioréacteur et sera éliminée dans l'effluent.
Cependant, étant donné que la concentration du nutriment limitant dans le chémostat ne peut pas dépasser la concentration dans le milieu affluent, le taux de croissance spécifique que les cellules peuvent atteindre dans le chémostat est généralement légèrement inférieur au taux de croissance spécifique maximal, car le taux de croissance spécifique augmente généralement avec la concentration en nutriments, tel que décrite par la cinétique de l'équation de Monod. Les taux de croissance spécifiques les plus élevés (μmax) que les cellules peuvent atteindre sont égaux au taux de dilution critique (D'c) :
où S est le substrat ou la concentration en nutriments dans le chémostat, et KS est la constante de demi-saturation (cette équation suppose une cinétique de Monod).
Applications
Recherche En recherche scientifique, les chémostats sont utilisés pour des études en biologie cellulaire, lorsque l'on a besoin d'utiliser de grands volumes de cellules ou de protéines uniformes. Le chémostat est souvent utilisé pour recueillir des données sur l'état d'équilibre d'un organisme afin de générer un modèle mathématique relatif à ses processus métaboliques. Les chémostats sont également utilisés comme microcosmes en écologie et en biologie évolutive. Dans un cas, la mutation/sélection est une nuisance, dans l'autre cas, c'est le processus souhaité qui est étudié. Les chémostats peuvent également être utilisés pour enrichir des types spécifiques de mutants bactériens en culture tels que les auxotrophes ou ceux qui sont résistants aux antibiotiques ou aux bactériophages pour une étude scientifique plus approfondie. Les variations du taux de dilution permettent d'étudier les stratégies métaboliques poursuivies par les organismes à différents taux de croissance.
La compétition pour les ressources uniques et multiples, l'évolution des voies d'acquisition et d'utilisation des ressources, le cross-feeding et la symbiose, l'antagonisme, la prédation et la compétition entre prédateurs sont autant de processus ayant été étudiés en écologie et en biologie évolutive à l'aide de chémostats.
Industrie Les chémostats sont fréquemment utilisés dans la fabrication industrielle d'éthanol. Dans ce cas, plusieurs chémostats sont utilisés en série, chacun maintenu à des concentrations décroissantes en sucre. Le chémostat sert également de modèle expérimental pour les cultures cellulaires continues dans l'industrie biotechnologique.
Préoccupations techniques
Le moussage entraîne un débordement avec un volume de liquide pas exactement constant. Certaines cellules très fragiles peuvent être détruites lors de l'agitation et de l'aération. Les cellules peuvent se développer sur les parois ou adhérer à d'autres surfaces, ce qui peut être résolu en traitant les parois de verre du récipient avec un silane pour les rendre hydrophobes. Cependant, les cellules seront sélectionnées (au fil des générations) pour être capables de s'attacher aux parois rendues hydrophobes, puisque celles qui pourront potentiellement développer cette capacité ne seront pas éliminées du système. Ces bactéries qui adhèrent fermement aux parois formant un biofilm sont difficiles à étudier dans des conditions de chémostat. Le mélange peut ne pas être vraiment uniforme, affectant la propriété dite "statique" du chémostat. L'égouttement du milieu dans le réacteur entraîne en fait de petites impulsions de nutriments et donc des oscillations de concentrations, affectant à nouveau la propriété "statique" du chémostat. Les bactéries voyagent assez facilement vers la source d'affluent. Elles atteindront rapidement le réservoir de milieu stérile, à moins que le trajet du liquide ne soit interrompu par une coupure d'air dans laquelle le milieu tombe goutte à goutte dans la partie aérienne du réacteur.
Des efforts continus pour remédier à chaque défaut conduisent à des variations assez régulières du modèle basique du chémostat. Les exemples illustrant ces améliorations sont nombreux dans la littérature.
Des agents anti-mousse sont utilisés pour supprimer la formation de mousse. L'agitation et l'aération peuvent se faire de façon plus douce. De nombreuses approches ont été adoptées pour réduire la croissance sur les parois. Diverses applications utilisent des sortes d'aubes, des bulles ou d'autres mécanismes pour mélanger. L'égouttement peut être rendu moins drastique avec des gouttelettes plus petites et des volumes de réacteur plus grands. De nombreuses améliorations ciblent la menace de contamination.
Considérations relatives à la conception expérimentale
Choix et configuration des paramètres La concentration à l'état d'équilibre du substrat limitant dans le chémostat est indépendante de la concentration de l'influx. La concentration de l'influx affectera la concentration cellulaire et donc la densité optique (DO) à l'état d'équilibre.
Même si la concentration de substrat limite dans le chémostat est généralement très faible et est maintenue par des impulsions d'influx discrètes hautement concentrées, en pratique, la variation temporelle de la concentration dans le chémostat est faible (quelques pour cent ou moins) et peut donc être considérée comme état quasi-stationnaire.
Le temps nécessaire à la (DO) pour converger vers une valeur d'état d'équilibre (dépassement/sous-dépassement) sera souvent long (renouvellements multiples de chémostats), en particulier lorsque l'inoculum initial est important. Mais ce temps peut être minimisé avec un choix de paramètres approprié.
Croissance à l'état d'équilibre Un chémostat peut sembler être dans un état stable, mais des prises de contrôle par des souches mutantes peuvent se produire en continu, même si elles ne sont pas détectables en surveillant des paramètres à grande échelle comme la DO ou les concentrations de produits.
Le substrat limitant est généralement à des concentrations si faibles qu'il est indétectable. En conséquence, la concentration du substrat limitant peut varier considérablement au fil du temps (en pourcentage) à mesure que différentes souches envahissent la population, même si les changements résultants de la DO sont trop faibles pour être détectés.
Un chémostat en mode "pulse" (avec de très grandes impulsions d'influx) a une capacité sélective sensiblement inférieure à un chémostat quasi-continu standard, pour une souche mutante avec une aptitude accrue dans des conditions limitantes.
En abaissant brusquement la concentration de substrat limitant l'influx, il est possible de soumettre temporairement les cellules à des conditions relativement plus dures, jusqu'à ce que le chémostat se stabilise à l'état d'équilibre (sur l'ordre temporel du taux de dilution D).
Mutation
Certains types de souches mutantes apparaîtront rapidement. S'il existe un SNP qui peut augmenter l'aptitude, il devrait apparaître dans la population après seulement quelques doublements de chémostat, pour des chémostats typiquement grands (par exemple 1011 cellules d'E. coli).