La coloration au bleu de méthylène de Loeffler est une technique de coloration des bactéries décrite en 1884 par F. Loeffler dans sa monographie consacrée à la bactérie pathogène Corynebacterium diphtheriae, responsable de la diphtérieLoeffler F. Untersuchungen über die Bedeutung der Mikroorganismen für die Entstehtung der Diphtherie beim Menschen, bei der Taube und beim Kalbe. Berlin : 1884, L. Schumacher, p. 439. Accès libre (ouvrage en allemand).. Reprenant la méthode de R. Koch lui-même, qui lui a permis deux ans plus tôt de colorer les bacilles tuberculeux et de démontrer l'étiologie bactérienne de la tuberculoseKoch R « Die Aetiologie der Tuberculose » Berliner klinische Wochenschrift 1882;19(15):221-230. Accès libre (article en allemand).Koch R « Die Aetiologie der Tuberkulose » in : Dr. Struck (ed.) Mittheilungen aus dem Kaiserlichen Gesundheitsamt, zweiter Band. Berlin : Verlag von August Hirschwald, 1884, pp. 1-88. Accès libre (ouvrage en allemand)., Loeffler emploie une solution alcaline plus concentrée de bleu de méthylène pour colorer rapidement et intensément les Corynébactéries. Cette coloration fait partie des techniques citées par l'OMS pour le diagnostic biologique de la diphtérie, en complément de la coloration de Gram dont les résultats variables ou faussement négatifs sur C. diphtheriae peuvent perturber le diagnosticWorld Health Organization. WHO laboratory manual for the diagnosis of diphtheria and other related infections. OMS, Genève, 2022, p. 16. Accès libre.. Elle s'applique aussi à la coloration d'autres bactéries, notamment Helicobacter pylori.
Réalisation Les solutions utilisées pour la coloration sont préparées de la manière suivanteDownes FP & Ito K (eds.) Compendium of methods for the microbiological examination of foods. Washington, DC : American public health association, 4th ed, 2001, p. 648. : dissoudre 300 mg de bleu de méthylène dans 30 mL d'éthanol absolu (pur) ; dissoudre 10 mg (ou 1 mL d'une solution à 10 g/L) d'hydroxyde de potassium dans 100 mL d'eau distillée ; mélanger les deux solutions.
Les étapes de la coloration sont les suivantes : préparer et le frottis contenant les bactéries ; couvrir le frottis de solution alcaline de bleu de méthylène et laisser agir quelques minutes ; rincer à l'eau distillée, sécher par tamponnement et observer à l'objectif à immersion.
Un protocole décrit en 1944 combine coloration primaire au bleu de méthylène de Loeffler, décoloration rapide à l'acide sulfurique très dilué et contre-coloration à l'éosine pour visualiser les granules de de C. diphtheriaeGohar MA « A staining method for Corynebacterium diphtheriae » J Bacteriol. 1944;47(6):575. .
Domaine d'application et performances La coloration au bleu de méthylène de Loeffler reste préconisée pour le diagnostic biologique de la diphtérie dans les publications récentes de l'ASMJorgensen JH & Pfaller MA (eds.) Manual of clinical microbiology. Washington, DC : ASM Press, 11th ed, 2015, pp. 300 et 480 Snyder JW « 3.11.7 Corynebacterium diphtheriae Cultures » in: Leber AL (ed.) Clinical microbiology procedures handbook. Washington, DC : ASM Press, 4th ed, 2016, p. 3.11.7.2 . Malgré sa sensibilité limitée, elle peut permettre de visualiser au microscope l'aspect classique de C. diphtheriae : bacilles pléiomorphes, rayés ou perlés, aux extrémités parfois élargies (« forme de massue ») par des granules métachromatiques violet rougeâtres, disposés à angle aigu les uns à côté des autres (« en palissade » ou « en lettres chinoises »).
L'application à la détection de H. pylori dans les tissus est décrite depuis les années 1990Tedla Z « Helicobacter pylori infection in patients with upper gastrointestinal symptoms in Arba Minch Hospital: southwestern Ethiopia » Ethiop Med J. 1992;30(1):43-49.Misra V « The Loeffler's methylene blue stain: an inexpensive and rapid method for detection of Helicobacter pylori » J Gastroenterol Hepatol. 1994;9(5):512-513. . V. Misra rapportent cette utilisation du bleu de méthylène de Loeffler dans plusieurs publications plus récentes, comme colorant uniqueMisra V « A topographic study of Helicobacter pylori density, distribution and associated gastritis » J Gastroenterol Hepatol. 2000;15(7):737-743. ou le plus souvent combiné à d'autres techniquesMisra V « Helicobacter pylori in areas of gastric metaplasia in the gallbladder and isolation of H. pylori DNA from gallstones » Pathology 2007;39(4):419-424. Misra V « Significance of cytomorphological and microbiological examination of bile collected by endoscopic cannulation of the papilla of Vater » Indian J Pathol Microbiol. 2009;52(3):328-331. Jindal Y « Expression of alpha methylacyl CoA racemase (AMACR) in gastric adenocarcinoma and its correlation with Helicobacter pylori infection » J Clin Diagn Res. 2016;10(10):EC10-EC12. .
Cette coloration a été mise en œuvre pour le diagnostic de sepsis chez des nouveau-nés par examen direct de la couche leucocytaire du sang total, avec une valeur prédictive positive de 94% (identique au Gram et supérieure à l'orange d'acridine) et une spécificité de 97% (supérieure aux deux autres colorations et à la PCR bactérienne universelle dirigée contre l'ARNr 16S) par rapport à l'approche diagnostique conventionnelle (clinique, biologie et hémocultures)García-Elorriaga G « The usefulness of the buffy coat smear and panbacterial polymerase chain reaction in early diagnosis of neonatal sepsis » Rev Invest Clin. 2012;64(3):275-83. Accès libre. Elle a aussi servi à la visualisation de bactéries aquatiques localisées à la surface et à l'intérieur des cristaux de carbonate de calcium qu'elles avaient formésZamarreño DV « Carbonate crystals precipitated by freshwater bacteria and their use as a limestone consolidant » Appl Environ Microbiol. 2009;75(18):5981–5990. .
Notes et références
Catégorie:Bactériologie Catégorie:Coloration histologique