La nick translation (ou translation de tête ), développée en 1977 par Peter Rigby et Paul Berg, est une technique de marquage en biologie moléculaire. L'ADN polymérase I remplace certains nucléotides d'une séquence d'ADN par leurs analogues marqués, créant ainsi une séquence d'ADN marquée pouvant servir de sonde en hybridation in situ fluorescente (FISH) ou en transfert. Elle peut également être utilisée pour le radiomarquage .
Ce processus est appelé « réplication de coupure » (en anglais nick translation) car l'ADN d'intérêt est traité par une DNAse pour produire des coupures monocaténaires, rendant l'un des brins dépourvu de nucléotides. Ceci est suivi par le remplacement des sites coupés par l'ADN polymérase I, qui retire les nucléotides de l'extrémité 3' (en aval) d'une coupure grâce à son activité endonucléase 3'-5' et ajoute de nouveaux dNTP marqués présents dans le milieu à l'extrémité 5' de la coupure, déplaçant ainsi la coupure en aval du processus et rendant l'ADN au niveau de la coupure anciennement simple brin double brin.
Pour marquer radioactivement un fragment d'ADN afin de l'utiliser comme sonde dans les procédures de transfert, l'un des nucléotides incorporés dans la réaction est radiomarqué en position alpha- phosphate, souvent à l'aide de phosphore-32 . De plus, un fluorophore peut être fixé à la place pour le marquage fluorescent, ou un antigène pour l'immunodétection. Lorsque l'ADN polymérase I se détache finalement de l'ADN, elle laisse une autre coupure dans le squelette phosphate. La distance parcourue par la coupure dépend de la processivité de la polymérase. Cette coupure peut être scellée par l'ADN ligase, ou son groupe hydroxyle 3' pourrait servir de matrice pour une activité ultérieure de l'ADN polymérase I. Des mélanges d'enzymes brevetés sont disponibles dans le commerce pour réaliser toutes les étapes de la procédure en une seule incubation.
La nick translation pourrait provoquer des cassures de l'ADN double brin si l'ADN polymérase I rencontre une autre coupure sur le brin opposé, produisant ainsi deux fragments plus courts. Cela n'influence pas les performances de la sonde marquée en hybridation in situ.
Références
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