La chromatographie d'exclusion stérique (SEC pour size exclusion chromatography en anglais) est une méthode de chromatographie en phase liquide permettant de séparer des macromolécules en fonction de leur volume hydrodynamique. Elle est notamment utilisée pour faire l'étude de polymères. Suivant la nature des deux phases en présence, elle est encore désignée par chromatographie sur gel perméable (GPC pour gel permeation chromatography) ou par filtration sur gel (GFC pour gel filtration chromatography).
Principes de l'exclusion stérique
Contrairement aux méthodes de chromatographie d'affinité (comme l'high performance liquid chromatography), le principal phénomène physique permettant la séparation des différentes macromolécules constituant le polymère n'est pas basé sur l'affinité chimique avec le support, mais idéalement sur la taille des macromolécules en solution (leur volume hydrodynamique). En réalité, ces deux mécanismes de séparation sont continuellement en compétition au sein de la colonne; les conditions expérimentales sont alors établies pour minimiser les mécanismes enthalpiques d'affinité au profit de ceux entropiques d'exclusion stérique.
Le mécanisme d'exclusion stérique est fondé sur l’équilibre thermodynamique entre deux phases, le solvant interstitiel dans le volume mort et le solvant contenu dans le volume poreux . Si est le coefficient de partage, le volume d’élution d’une macromolécule est défini par :
L’évolution du coefficient de partage en fonction, d’une part de la taille de la chaîne macromoléculaire et de sa topologie, d’autre part de la distribution de la taille des pores, a une origine purement entropique. La fonction de partage d’une chaîne de taille donnée, à l’intérieur d’un pore de volume dont la paroi est impénétrable, peut être obtenue par l’énumération de toutes les conformations possibles prises au hasard. Les macromolécules dessinées en ligne continue correspondent aux conformations autorisées et les macromolécules dessinées en pointillé correspondent aux conformations impossibles car franchissant la paroi. Le coefficient de partage est lié au rapport des nombres des conformations autorisées et impossibles.
Suivant leur taille, les molécules éluées peuvent plus ou moins pénétrer dans les pores de la phase stationnaire, un gel polymère dont sont remplies les colonnes. Ainsi, les molécules les plus petites sont davantage retenues que les plus grosses, d'où un temps de rétention plus long pour les premières que pour les secondes. Chaque colonne possède un domaine de séparation spécifique: les macromolécules dont le volume hydrodynamique est trop important éluent dans le volume mort, tandis que celles trop petites éluent avec l'éluant en fin d'injection. L'analyse de données hors de ce domaine de séparation n'apporte donc aucune information.
En sortie de colonne, des détecteurs (réfractomètre, diffusion de la lumière, viscosimètre) fournissent des données relatives aux macromolécules sortant de la colonne à un instant donné.
Étalonnage de la colonne Étalonnage conventionnel Pour obtenir des valeurs approchées des masses molaires moyennes des polymères, il est nécessaire d'établir une ou plusieurs courbes d'étalonnage indiquant la masse molaire moyenne en fonction du volume hydrodynamique des macromolécules.
L'étalonnage est réalisé en injectant une série d'échantillons de polymères d'architecture, de faible polydispersité et de masse molaire moyenne connue. Les standards utilisés sont généralement des polystyrènes ou des polyméthyméthacrylates linéaires; le choix du standard se fait en fonction du système éluant/colonne. Le tracé du logarithme de leur masse molaire moyenne en fonction du volume de rétention (calculé à partir du temps de rétention expérimental et du débit choisi) permet d'établir la courbe d'étalonnage. Cette courbe peut être modélisé par un polynôme d'ordre 3. Le volume hydrodynamique peut être différent pour deux macromolécules de même masse molaire moyenne mais d'architecture différente. Une macromolécule non linéaire (par exemple, en peigne) occupera un plus grand volume qu'une macromolécule linéaire de même masse molaire moyenne et sera donc éluée plus rapidement même si les deux masses molaires sont identiques. Il faut donc réaliser différentes courbes d'étalonnage pour chaque type d'architecture du même polymère.
Étalonnage universel La méthode de calibration conventionnelle n’est valable uniquement que pour un couple polymère-solvant donné, chaque couple nécessitant sa propre courbe d’étalonnage. Pour s'affranchir de ce problème, il est possible de réaliser un étalonnage universel permettant de déterminer les masses molaires moyennes de polymères d'architecture ou de composition chimique différentes.
La méthode la plus simple pour réaliser la calibration universelle est d'utiliser l'équation de Mark-Houwink-Sakurada, si les coefficients de Mark-Houwink-Sakurada sont connus pour le couple polymère/éluant/température de colonne. Cette méthode ne s'applique toutefois pas aux oligomères et aux polymères branchés dont les mécanismes de séparation dans la colonne ne peuvent uniquement être expliqués par l'exclusion stérique.
L'autre solution consiste à utiliser un viscosimètre, ce qui permet d'établir une relation directe entre le volume hydrodynamique et la masse molaire moyenne d'un polymère.
Appareillage L’appareillage de SEC est un appareillage semblable à ceux utilisés en HPLC classique et est très largement disponible auprès de nombreux fournisseurs. La SEC est constitué d’un réservoir de solvant, d’un système de pompage, d’un injecteur, d’un jeu de colonnes et de détecteurs disposés en sortie de colonne.
Solvant Le solvant est filtré par un filtre en ligne et ensuite dégazé à l’aide d’un dégazeur connecté en série.
Système de pompage Le système de pompage doit être très précis et capable de travailler à haute pression (jusqu'à 200 à 300 bar). Il doit délivrer le solvant à un débit extrêmement constant et aussi reproductible que possible pour pouvoir convertir précisément les temps d’élution en volumes d’élution et utiliser avec précision la courbe d’étalonnage. Dans les conditions classiques, le débit est de l’ordre de 1 mL/min.
Injecteur Le système de pompage est suivi d’un injecteur pour permettre l’introduction des échantillons. Le système le plus utilisé est l’injecteur à boucle qui permet d’injecter, sous haute pression, des quantités très reproductibles. Pour des colonnes classiques (30 cm de long et 7,2 mm de diamètre interne), le volume injecté ne doit pas dépasser 100 μL par colonne pour ne pas détruire les performances de la colonne (évaluée par son nombre de plateaux théoriques).
Colonne Tous les composants de l’appareil de SEC sont reliés par des connexions à faible volume mort et des tubes capillaires (en acier inoxydable ou en plastique) pour minimiser l’élargissement des pics dû à l’appareillage.
L’efficacité des colonnes (évaluée en nombre de plateaux théoriques) peut être améliorée en augmentant la température, ce qui réduit aussi la pression dans la colonne.
Détecteurs Les détecteurs utilisé en CES peuvent être classés en deux groupes : les détecteurs qui donnent des résultats proportionnels à la concentration du polymère dans la solution : réfractomètre différentiel, détecteurs par spectroscopie d'absorption et détecteurs de masse volumique ; les détecteur qui donnent des résultats proportionnels à la masse molaire moyenne en masse des polymères : viscosimètre, osmomètre continu, détecteurs à diffusion de la lumièreTrathnigg, B. Determination of MWD and Chemical Composition of Polymers by Chromatographic Techniques. Prog. Polym. Sci. 1995, 20, 615-650. .
Réfractomètre différentiel Contrairement à la chromatographie liquide classique, le détecteur le plus communément utilisé est le réfractomètre différentiel qui produit un signal proportionnel à la masse et donc à la concentration du polymère. Le détecteur mesure une différence en indice de réfraction entre une cellule étalon qui contient de l'éluant pur et une cellule de détection où s'écoule l'échantillon élué. La cellule de détection a habituellement un volume de 10 μL pour minimiser le remélangeage et l’élargissement de bande.
Ce détecteur n’est pas particulièrement sensible, l'incrément d'indice de réfraction pouvant être très faible pour certains polymères, mais il a l’avantage d’être non spécifique et universel. Le réfractomètre est également extrêmement sensible aux variations de température et, comme une sensibilité de l’ordre de 10–7 unité d’indice de réfraction est nécessaire pour détecter les solutés à la sortie des colonnes, la température doit être stabilisée très soigneusement.
Spectroscopie d'absorption Le spectromètre UV est parfois utilisé seul comme détecteur de concentration, mais il est plutôt couplé au réfractomètre comme détecteur secondaire de concentration pour l’analyse de composition, en particulier dans le cas des copolymères. Le spectromètre UV doit être réglé à une longueur d’onde particulière, à laquelle le soluté absorbe et le solvant est transparent. Le polymère doit posséder un bon coefficient d’absorption pour y être détecté. D’autres spectromètres, comme le spectromètre IR (absorbant dans l’infrarouge), sont aussi utilisés, par exemple pour l’analyse des polyoléfines. Les cellules de ces détecteurs ont habituellement un volume d’environ 10 μL
Viscosimètres La détection viscométrique est particulièrement adaptée à l’utilisation de l’étalonnage universel car elle fournit une information de viscosité intrinsèque, nécessaire pour utiliser le paramètre • M. Au début, un viscosimètre Ubbelhode classique était simplement installé à la suite du réfractomètre. Ce montage n’est plus possible avec les colonnes modernes de SEC en raison de leur faible volume interne. En 1972, Oùano propose un autre type de viscosimètre fondé sur la mesure de la perte de charge dans un tube capillaire à l’aide d’un capteur de pression. Un viscosimètre, il a été amélioré depuis par l’utilisation d’un capteur de pression différentiel et d’un capillaire à faible volume mort.
À débit Q de solvant constant, la pression est directement proportionnelle à la viscosité. À viscosité constante, P est proportionnel au débit Q, ce qui donne un débitmètre extrêmement sensible. Par conséquent, le viscosimètre à simple capillaire, est très sensible aux fluctuations de débit et il est nécessaire d’utiliser un système de pompage renforcé avec un débit extrêmement stable débarrassé des à-coups de pression. Pour cette raison, ce viscosimètre peut être considéré comme un outil de diagnostic pour le système de pompage et même pour le reste de l’appareil, en plus de son utilisation plus fondamentale avec l’étalonnage universel. La détection viscosimétrique est aussi essentielle pour l’étude des ramifications longues dans les polymères. Ce sont des viscosimètres différentiels qui comportent plusieurs capillaires et plusieurs capteurs de pression et utilisent un volume de délai pour permettre une compensation de débit. Dans ce cas, le signal viscosimétrique différentiel est insensible aux variations de débit mais le signal réel doit être reconstruit à l’aide d’une mesure annexe de la ligne de base.
Détecteurs par diffusion de la lumière