Immunoprécipitation

L'immunoprécipitation (IP) est la technique qui permet la précipitation d'un antigène (protéine) en solution par un anticorps qui agglutine spécifiquement une protéine particulière. On l'utilise pour isoler et concentrer une protéine précise parmi des milliers d'autres. L'immunoprécipitation impose que l'anticorps soit lié à un substrat solide à certaines étapes du traitement.

Diverses immunoprécipitations

Immunoprécipitation d'une protéine

L'immunoprécipitation permet l'isolement d'une protéine dans une solution en contenant beaucoup d'autres. Il peut s'agir d'un lysat brut Un lysat brut (crude lysate) est une solution obtenue quand les cellules sont détruites par rupture de leur membrane cellulaire selon un processus appelé « cytolyse ». On peut consulter l'article de la Wikipedia anglophone : Crude lysate. de tissus biologiques végétaux ou animaux, de fluides corporels ou d'autres produits aqueux d'origine biologique.

Immunoprécipitation d'un complexe de protéines (co-IP)

L'immunoprécipitation d'un complexe de protéines repose sur la sélection d'un anticorps correspondant à une protéine qu'on suppose faire partie du complexe. L'agglutination de cette protéine rend en principe possible l'extraction de tout le complexe auquel elle appartient, et donc l'identification des autres protéines qui le composent. Il faut pour cela que les protéines soient suffisamment liées pour que l'extraction de l'une d'entre elles entraîne l'ensemble du groupe sans provoquer sa dissociation. Cette technique est souvent utilisée en biologie moléculaire pour analyser les interactions protéine-protéine.

Plusieurs précipitations avec différents anticorps sont souvent nécessaires pour identifier les différentes protéines d'un complexe. En effet, un anticorps sélectionne souvent une sous–population des protéines recherchées selon la visibilité de l'épitope, ne « voyant » pas les protéines du complexe dont l'épitope est masqué. Ceci se vérifie par le fait qu'un anticorps précipite le plus souvent moins de la moitié des protéines cibles, même s'il est en net excès dans la solution. De plus, une première immunoprécipitation permet souvent d'identifier de nouvelles protéines du complexe étudié. L'expérimentateur va alors choisir des anticorps spécifiques des nouvelles protéines trouvées et va répéter l'ensemble de la manipulation qui doit révéler d'autres protéines du complexe. En répétant l'opération, le nombre de protéines trouvées continuera d'augmenter. Les différentes protéines identifiées peuvent ne pas exister toutes ensemble dans un seul complexe, mais être des protéines qui interagissent entre elles à différents moments, pour différentes raisons. Enfin, la répétition de la manipulation à la recherche de nouvelles protéines permet aussi d'opérer un contrôle des résultats : chaque précipitation doit permettre de trouver, à la fois, la protéine de départ, celles qui ont été trouvées dans les précipitations précédentes, et éventuellement, de nouvelles protéines. L'expérimentateur peut ainsi s'assurer de la validité de ses conclusions. Si une protéine particulière n'apparaît que lorsqu'on la cible spécifiquement, et pas lorsqu'on cible les autres protéines, se pose la question de la réalité de son appartenance au complexe.

Immunoprécipitation de chromatine

L'immunoprécipitation de la chromatine est une méthode qui permet de déterminer les sites de liaison de l'ADN sur le génome pour une protéine particulière et donne accès à une représentation des interactions protéine–ADN qui ont lieu dans le noyau de la cellule vivante ou dans les tissus. La mise en œuvre in vivo de cette méthode est bien différente de celles qui sont généralement utilisées.

Le principe à la base de ce procédé est que les protéines qui se lient à l'ADN (y compris les facteurs de transcription et les histones) peuvent être réticulées avec l'ADN auquel elles sont liées. En employant un anticorps spécifique d'une protéine présumée liée à l'ADN, on peut faire une immunoprécipitation du complexe protéine–ADN du lysat cellulaire. La réticulation s'obtient souvent par l'action du formaldéhyde sur les cellules (ou les tissus), encore qu'il soit parfois plus intéressant d'utiliser un réactif plus approprié comme le DTBP (peroxyde de di-tert-butyle). Après la réticulation, les cellules sont lysées et l'ADN est scindé en morceaux de à (kilobase) de longueur à l'aide d'un bain à ultrasons. À ce stade, on procède à l'immunoprécipitation pour obtenir des complexes protéine–ADN purifiés. Ces complexes purifiés sont alors chauffés pour annuler la réticulation par le formaldéhyde et l'ADN peut être séparé des protéines. L'identification et le dénombrement des fragments d'ADN peuvent être obtenus par réaction en chaîne par polymérase (PCR). Une des limites de l'utilisation de la PCR sur des fragments isolés est qu'il faut avoir une idée de la région du génome qui a été ciblée pour pouvoir générer les bonnes amorces par PCR. Cette limite est facilement contournable en clonant l'ADN du génome isolé dans un vecteur plasmidique et en utilisant ensuite des amorces spécifiques de la zone de clonage de ce vecteur. En revanche, quand on veut déterminer où la protéine est liée sur un génome à grande échelle, on peut utiliser une puce à ADN (Chip on chip) qui permet la détermination du cistrome. De la même manière, le chip–sequencingLe chip–sequencing est utilisé pour l'analyse des interactions des protéines avec l'ADN. Cette technique associe l'immunoprécipitation de la chromatine avec le séquençage de l'ADN pour identifier les sites où les protéines sont associées à l'ADN. On peut lire sur la Wikipedia anglophone l'article : Chip–Sequencing., une technologie nouvelle, permet de localiser les sites de liaison à cadence élevée, ce qui est très rentable sur le plan du coût.

Immunoprécipitation d'ARN

Assez semblable à l'immunoprécipitation de la chromatine, l'immunoprécipitation de l'ARN concerne les protéines liées à l'ARN au lieu de celles liées à l'ADN. L'immunoprécipitation de l'ARN est aussi une technique in vivo dans laquelle on utilise également le formaldéhyde pour créer des réticulations entre l'ARN et les protéines liées à l'ARN. Ensuite, les cellules sont lysées et on procède à l'immunoprécipitation avec un anticorps adapté à la protéine que l'on souhaite étudier. En isolant la protéine, l'ARN sera également isolé puisqu'il est lié à la molécule par réticulation. Le complexe protéine–ARN purifié peut-être séparé par destruction de la réticulation, et l'identification de l'ARN peut-être obtenue par séquençage de l'ADN JR Sanford, X Wang, M Mort et al, Splicing factor SFRS1 recognizes a functionally diverse landscape of RNA transcripts, Genome Res., volume 19, pages 381 à 394, mars 2009. ou RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction).

Protéines marquées par des étiquettes

Un des problèmes majeurs de l'immunoprécipitation est la difficulté de disposer d'anticorps spécifiques à une seule protéine. Pour contourner cet obstacle, plusieurs équipes de recherche ont mis au point des techniques de marquage soit de l'atome de carbone (C), soit de l'atome d'azote (N), terminal de la protéine étudiée. Un des avantages du procédé est qu'une seule étiquette peut permettre la précipitation de protéines différentes avec le même anticorps. L'intérêt de cette méthode est tel qu'elle a supplanté les autres techniques d'immunoprécipitation, y compris celles décrites ci-dessus. Parmi les étiquettes le plus couramment utilisées, on peut citer la protéine fluorescente verte, le glutathion-S-transférase (GST) et le Flag-tagLe Flag-tag est une étiquette de protéine polypeptidique qui peut être associé à une protéine en utilisant la technique de l'ADN recombinant. On peut lire l'article de la Wikipedia anglophone : FLAG-tag.. Alors que la méthode de l'étiquette convient tout à fait pour permettre des dépliages, elle introduit quelques difficultés en ce qui concerne la pertinence biologique parce que l'étiquette peut occulter des interactions naissantes ou, à l'inverse, induire des réactions anormales.

Différentes méthodes

Les deux méthodes les plus courantes pour l'immunoprécipitation sont la « capture directe » et la « capture indirecte ».

Capture directe

Les anticorps spécifiques d'une certaine protéine (ou d'un groupe de protéines) sont immobilisés sur un substrat en phase solide comme des billes superparamagnétiques microscopiques ou des billes d'agarose microscopiques (non–magnétiques). Les billes et les anticorps sont alors ajoutées au mélange de protéines, et les protéines correspondant aux anticorps sont capturées, via les anticorps, sur les billes (c'est-à-dire « immunoprécipitées »).

Capture indirecte

Les anticorps spécifiques d'une certaine protéine, ou d'un groupe de protéines, sont ajoutés directement au mélange de protéines. Les anticorps n'ont pas encore été attachés à un support en phase solide et restent donc libres de flotter dans le mélange de protéines pour aller se fixer sur leurs « cibles ». Au fur et à mesure, on ajoute les billes enrobées de protéines A/GUne protéine A/G est une protéine de fusion qui combine les domaines bloquants de l'immunoglobuline G (IgG) à la fois d'une protéine A et d'une protéine G. au mélange d'anticorps et de protéines. À ce stade, les anticorps qui sont maintenant liés aux protéines qui leur correspondent vont s'agglutiner sur les billes. À partir de cette étape, les méthodes par capture directe et indirecte se rejoignent car nous sommes en présence de mélanges contenant les mêmes ingrédients. Les deux protocoles donnent finalement les mêmes résultats avec des protéines, ou des complexes de protéines, liées aux anticorps, eux-mêmes fixés sur les billes.

Sélection

Parfois, on privilégie l'approche indirecte lorsque, soit la concentration de la protéine étudiée, soit l'affinité spécifique de l'anticorps utilisé, sont faibles. La méthode indirecte est aussi appréciable lorsque la vitesse de liaison de l'anticorps et de la protéine est lente. À ces exceptions près, la méthode directe est le meilleur choix dans la plupart des cas.

Progrès technologiques

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