Pendant la mise au point de nouveaux médicaments, une grandeur pharmacologique est très importante : c'est dans quelle mesure une substance est capable de traverser la barrière hémato-encéphalique (en anglais brain uptake). Ceci est important tant pour les médicaments psychotropes, qui doivent exercer leur action dans le système nerveux central, que pour les médicaments destinés aux organes périphériques, et qui ne doivent surtout pas y pénétrer (article de revue).. Pour la recherche du débit et du mécanisme de pénétration dans la barrière hémato-encéphalique d'une substance donnée, une série de méthodes différentes ont été mises au point dans le passé. Les procédés classiques travaillent sur des organismes modèles in vivo. Comme la barrière hémato-encéphalique est construite pratiquement de la même manière chez tous les mammifères, les résultats obtenus in vivo se transposent avec une bonne précision à l'homme. Des méthodes plus modernes utilisent des cultures de cellules (in vitro), et tout dernièrement, on a commencé à travailler avec des simulations sur ordinateur (in silico) (article de revue)..
Bases physiques Un modèle simplifié, basé sur un seul capillaire a été mis au point par Renkin (1959) et Crone (1965) pour mesurer la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique. Malgré les simplifications, ce modèle est la meilleure approximation des conditions réelles. Le produit perméabilité-surface (anglais : permeability surface area product) PS est une mesure de la perméabilité globale de l'échantillon de capillaire. Ce produit, aussi désigné comme « constante de Crone-Renkin », est le produit du coefficient de perméabilité d'une substance donnée et de la surface disponible pour le transfert. L'unité de mesure est ml•min•g (g pour la masse de tissu mouillé), et correspond au débit sanguin Q. La fraction unidirectionnelle extraite E est la fraction d'une substance qui passe dans le cerveau en un seul passage. Elle est donnée par :
Quand le débit Q est plus petit que le produit perméabilité-surface PS, le transfert de matière est limité par l'apport sanguin. Inversement, pour Q plus grand que PS, le transfert de matière est limité par la perméabilité (article de revue)..
Par principe, la valeur de E est toujours inférieure à 1 pour toutes les substances, car l'influx ne peut pas être supérieur à l'apport sanguin. Pour des valeurs inférieures à 0,2, on dit d'habitude que c'est la perméabilité qui est le facteur limitant pour le transport au cerveau. Dans le domaine , on dit que la perméabilité est modérée.
Procédés in silico Les procédés de simulation sont utilisés avant tout dans la phase de tout début de la mise au point d'une substance, le drug design. Les modèles de calcul se limitent actuellement à la diffusion passive et à quelques descripteurs moléculaires, tels que la lipophilie, la charge, la masse molaire et le nombre de liaisons hydrogène.
Procédés in vitro thumb|250px|Incubateur pour culture de cellules.Dans les cellules endothéliales en culture on peut faire une quantité de recherches quantitatives sur le comportement des substances à la barrière hémato-encéphalique. Le procédé in vitro le plus simple est l’utilisation de vaisseaux isolés, encore vivants. On peut y faire des recherches sur les mécanismes de transport au niveau cellulaire (article de revue). Et l'on peut parfois utiliser pour cela des capillaires humains issus d'autopsies. Les capillaires sont encore actifs sur le plan métabolique après le prélèvement, même si la provision d'ATP dans les cellules est largement entamée. Dans ce processus, cependant, les deux faces, luminale et abluminale, des cellules endothéliales sont exposées à la substance étudiée. Il n'est donc pas possible de faire une différence entre les deux faces en ce qui concerne leur interaction avec la substance. Au moyen de la microscopie à fluorescence confocale, on peut analyser la distribution spatiale sur les capillaires incubés. Par exemple, on peut étudier l'absorption d'anticorps monoclonaux sur le récepteur de la transferrine. La méthode peut être raffinée au point de permettre des dosages semi-quantitatifs sur l'efflux de substances du côté luminal des endothéliums.
Avec des lignées de cellules endothéliales immortalisées, on peut obtenir des résultats quantitatifs sur la perméabilité à une substance. Il y a maintenant une grande variété de lignées. Celles-ci sont utilisées aussi bien pour la recherche fondamentale que pour la mise au point de médicaments (article de revue).. Les cellules endothéliales sont, comme dans le capillaire, entretenues en couches simples (monolayer). La qualité de ces couches se juge par exemple par la résistance électrique de la couche épithéliale (trans endothelial electrical resistance = TEER), qui doit se montrer aussi haute que possible. Dans l'organisme vivant, cette valeur est supérieure à , et dépend de façon primordiale de la qualité des jonctions serrées. In vitro, on n'atteint que des valeurs inférieures d'un ordre de grandeur au mieux à cette valeur. Ces valeurs s'améliorent substantiellement si l'on utilise des cultures mixtes d'astrocytes et de cellules endothéliales. Les astrocytes influencent positivement l'expression des gènes responsables de la formation des jonctions serrées. De cette manière, on peut atteindre des valeurs jusqu’à . Des valeurs également grandes peuvent aussi être atteintes sans astrocytes, mais en ajoutant du cortisol à la culture.
Procédés in vivo thumb|left|250px|Les rats de laboratoire sont des organismes modèles très utilisés pour les expériences in vivo sur la barrière hémato-encéphalique. Le premier procédé, utilisé par Paul Ehrlich pour représenter l'(im)perméabilité de la barrière hémato-encéphalique a été l'injection de colorants suivie de l'examen anatomique de l'animal. Les colorants susceptibles de franchir la barrière hémato-encéphalique colorent le milieu encéphalique de façon tenace. Le procédé est limité par le choix des colorants, et ne permet que des conclusions qualitatives. On utilise encore les colorants pour les recherches sur des lésions volontaires de la barrière hémato-encéphalique. Pour la même raison, la méthode de marquage par fluorescence – très couramment employées en microbiologie – sont totalement inadaptées pour les recherches sur les mécanismes de transport de petites molécules à la barrière hémato-encéphalique. Ce n'est que pour les très grosses molécules, comme les polypeptides, où les molécules de colorant fluorescent sont relativement petites par rapport à celle du peptide, que l'on peut utiliser le marquage par fluorescence.
Dans le passé, on a mis au point toute une série de procédés in vivo différents, que l'on trouve encore aujourd'hui en usage. En général, les méthodes in vivo sont les procédés de référence. Actuellement, on ne peut pas remplacer l'application intra-artérielle ou intra-veineuse d'un produit actif dans des conditions physiologiques réelles, puis l'analyse du tissu cérébral, par quelque procédé in vitro que ce soit, et encore moins par un calcul de simulation. Ce sont les procédés de plus haute sensibilité, avec lesquels on peut déterminer l'absorption d'une substance dans le cerveau, pendant de longues périodes, et avec de nombreuses occasions de passage à travers la barrière hémato-encéphalique.
Indice d'absorption cérébrale Les premières tentatives pour quantifier l'absorption de substances nutritives et actives à travers la barrière hémato-encéphalique ont été mises au point en 1970 par William H. Oldendorf. Une substance marquée radioactivement est injectée avec une substance de référence également marquée, directement dans l’artère carotide de l’animal (le plus souvent un rat). Environ après l'injection, l'animal est décapité, le cerveau isolé et la concentration des substances radioactives contenues est mesurée. On calcule l'indice d'absorption cérébrale (Brain Uptake Index ou BUI) par le double rapport entre les doses radioactives de la substance T injectée et de la substance de référence R entre l'injection et la dissection :
Ce procédé, en raison de l'intervalle très court dans lequel les substances doivent être injectées et peuvent pénétrer la barrière, n'est approprié que pour des substances qui pénètrent la barrière assez rapidement. Les composés hydrophiles, comme beaucoup de peptides, ne passent que lentement. Pour ce genre de substances, la méthode est inappropriée .
Les composés à rechercher sont la plupart du temps marqués au tritium ou au carbone 14. Les substances de référence sont l'eau tritiée ou le butanol au carbone 14. Ceci permet de maintenir au minimum le volume injecté : il est nécessaire de maintenir le volume inférieur à pour éviter les artefacts de circulation et de répartition des produits, car ceux-ci pourraient altérer la mesure du BUI. Le BUI par contre dépend peu de la concentration de la substance injectée.
Indice d'absorption cérébrale (BUI) de diverses substances (chez les lapins nouveau-nés)
Composé BUI [%] log P M (g/mol) Cytosine 1,2 -1,72 243,2 Urée 1,4 -1,52 60,1 Mannitol 2 -2,11 182,2 Thio-urée 5 -0,96 76,12 Éthylène glycol 18 -1,3 62,1 Acétamide 23 -1,1 59,1 Méthanol 103 -0,52 32 Propylène glycol 27 -0,92 76,1 Éthanol 107 -0,18 46,1 Butanol 117 0,93 74,1 Alcool benzylique 94 1,1 108,1 Phénobarbital 56 1,42 232,2 Phénazone 83 0,38 188,2 Caféine 103 0,02 194,2 Phénytoïne 71 2,4 252,3 Estradiol 94 2,61 272,4 Testostérone 85 3,28 288,4 Héroïne 87 1,14 369,4 Morphine 2,6 -0,2. 285,3 Nicotine 120 0,7 162,2
Les données, sauf indication contraire, proviennent de la référence.
Indice d'efflux cérébral Ce procédé, mis au point en 1995, permet de déterminer l'efflux d'une substance à partir du cerveau vers la circulation sanguine à travers la barrière hémato-encéphalique (article de revue)..
Comme pour l'indice d'absorption cérébrale, la substance à tester marquée radioactivement est injectée avec une substance de référence, radioactive aussi, directement dans le cerveau, par une microinjection. Cependant la substance de référence est choisie parmi celles les moins aptes à traverser la barrière hémato-encéphalique – souvent de l'inuline. Ici aussi, l'animal est décapité au bout d'un certain temps, et son cerveau est disséqué. La radioactivité est alors mesurée sur le même côté du cerveau (ipsilatéralement). De la fraction de la substance à tester T qui reste dans le cerveau, et similairement pour la substance de référence R, on définit l'indice d'efflux cérébral (Brain Efflux Index) BEI : .
Perfusion cérébrale
Dans la technique de perfusion, la substance à tester, toujours marquée radioactivement, est perfusée dans la carotide. Puis, après le sacrifice de l’animal, le cerveau est isolé et homogénéisé, et sa radioactivité est mesurée. L'avantage de la méthode est qu'une dégradation éventuelle du substrat dans le sang, par exemple par les enzymes qui s'y trouvent, se trouve largement empêché. Les animaux utilisés dans cette technique sont de préférence des cochons d'Inde, car leur carotide ne présente pas de bifurcation entre le cou et le cerveau, contrairement au cas du rat. Ceci permet d'élever le temps de perfusion jusqu'à , tandis que pour le rat, on ne peut pas dépasser . Cette méthode exige d'importants moyens. C'est pourquoi est n'est en réalité utilisée que pour des substances dont la stabilité dans le plasma est insuffisante, ou ne possèdent qu'une très faible possibilité de pénétrer dans le cerveau.
Une variante améliorée est la méthode d'appauvrissement de capillaires (Capillary Depletion Method). Elle consiste à séparer les capillaires du tissu nerveux par centrifugation. Ceci permet de distinguer entre une véritable perméation dans le cerveau et une simple endocytose dans l'endothélium capillaire.
Technique de diffusion d'indicateur