miniatura|dereita|Placa de microtitulación de 96 pozos que se está utilizando para un ELISA.
O ELISA, siglas do inglés enzyme-linked immunosorbent assay (ensaio inmunosorbente de encima ligado), é unha técnica de laboratorio que utiliza anticorpos e cambios de cor orixinados encimaticamente para identificar unha substancia.
O ELISA é un formato moi común de ensaio bioquímico analítico do tipo laboratorio húmido (wet-lab), que utiliza un inmunoensaio encimático (EIA) en fase sólida para detectar a presenza dunha substancia, xeralmente un antíxeno, nunha mostra líquida ou mostra húmida.
O ELISA foi utilizado como ferramenta para o diagnóstico médico e en patoloxía de plantas, e como unha comprobación do control de calidade en varias industrias.
Nesta técnica os antíxenos dunha mostra son unidos a unha superficie. Despois, aplícase un anticorpo sobre a superficie para que se una ao antíxeno. Este anticorpo está ligado a un encima, e, no paso final, engádese unha substancia que contén o substrato do encima. A reaccion que se produce orixina un sinal detectable, xeralmente un cambio de cor no substrato.
A realización dun ELISA implica normalmente utilizar polo menos un anticorpo con especificidade para un determinado antíxeno. A mostra que contén unha cantidade indeterminada de antíxeno é inmobilizada sobre un soporte sólido (xeralmente unha placa microtituladora de polistireno) que pode ser capturado non especificamente (por medio de adsorción á superficie) ou ben especificamente (por medio de captura por outro anticorpo específico do mesmo antíxeno, nun ELISA "sandwich"). Unha vez que o antíxeno é inmobilizado, engádese o anticorpo de detección, formando un complexo co antíxeno. O anticorpo de detección pode estar enlazado covalentemente a un encima, ou pode el mesmo ser detectado por un anticorpo secundario, que está enlazado a un encima por bioconxugación. Entre un paso e o seguinte, a placa é normalmente lavada cunha solución deterxente suave para eliminar calquera proteína ou anticorpo que non se unira especificamente. Despois do último paso de lavado, a placa revélase engadindo un substrato encimático para producir un sinal visibe, que indica a cantidade de antíxeno na mostra.
Hai que sinalar, que coa técnica ELISA poden realizarse tamén outras formas de ensaios de unión de ligandos e non só inmunoensaios, aínda que o nome leva o termo orixinal "immuno" debido ao uso común e á historia do desenvolvemento deste método. A técnica require esencialmente un axente ligante calquera que poida ser inmobilizado na fase sólida xunto cun axente de detección que se una especificamente e usa un encima para xerar un sinal que poida ser identificado axeitadamente. Entre lavado e lavado, só o ligando e a molécula á que se une especificamente permanecen unidos ou "inmunoadsorbidos" polas interaccións antíxeno-anticorpo á fase sólida, mentres que os compoñentes non específicos ou non unidos son arrastrados polo lavado. A diferenza doutros formatos de ensaios de laboratorio húmido espectrofotométricos no que pode reutilizarse o mesmo pozo de reacción (por exemplo unha cubeta) despois do lavado, as placas de ELISA teñen os produtos inmunoadsorbidos sobre a fase sólida, que é parte da placa, polo que non son facilmente reutilizables.
Principios
Como o ELISA é un ensaio bioquímico, implica a detección dun "analito" (é dicir, a substancia específica cuxa presenza se quere analizar cuantitativa ou cualitativamente) nunha mostra líquida por un método que usa reactivos líquidos durante a "análise" (é dicir, unha secuencia controlada de reaccións bioquímicas que xeran un sinal que pode ser cuantificado doadamente e interpretado como unha medida da cantidade de analito na mostra) que permanece en estado líquido e dentro da cámara de reacción ou pozo necesario para conter os reactivos. Este tipo de técnicas son o contrario dun método de "laboratorio seco" (dry lab), o cal pode usar tiras secas, e mesmo no caso de que a mostra sexa líquida (por exemplo, unha pequena pinga medida), o paso final de detección na análise "seca" implica a lectura dos resultados nunha tira seca por métodos como a reflectometría e non necesita unha cámara para conter a reacción para impedir que se verta ou se mesturen as mostras.
Como o ELISA é un ensaio heteroxéneo, separa algún compoñente da mestura de reacción analítica ao adsorber certos compoñentes sobre unha fase sólida que está inmobilizada fisicamente. No ELISA, engádese unha mostra líquida sobre unha fase estacionaria sólida con propiedades de unión especiais e ito vai seguido da adición secuencial de moitos reactivos líquidos, que son incubados e lavados producindo algún cambio óptico (por exemplo, unha reacción encimática que orixina unha cor) no líquido final do pozo de reacción no cal se mide a cantidade de analito. A "lectura" cualitativa está xeralmente baseada na detección da intensidade de luz transmitida por espectrofotometría, o cal implica a cuantitación da transmisión dalgunha lonxitude de onda de luz específica a través do líquido (e tamén do fondo transparente do pozo no formato de placa de pozos múltiples). A sensibilidade da detección depende da amplificación do sinal durante as reaccións analíticas. Dado que as reaccións encimáticas son procesos de amplificación ben coñecidos, o sinal xérano encimas que están ligados a axentes reactivos en proporcións fixadas para permitir unha cuantificación precisa, de onde vén o nome de "ligado a encima" do proceso.
O analito tamén se chama ligando porque se une ou liga especificamente a un reactivo de detección, polo que o ELISA entra dentro da categoría máis ampla dos ensaios de unión de ligandos. O reactivo de unión específico de ligando é "inmobilizado", é dicir, normalmente cuberto e secado no fondo transparente e ás veces tamén na parede lateral do pozo (a "fase sólida"/"substrato sólido" estacionario aquí oponse a micopartículas sólidas/esferas doutras técnicas que poden ser retiradas polo lavado), e dita fase sólida normalmente é construída como unha placa de pozos múltiples coñecida como "placa de ELISA". Convencionalmente, igual que noutras formas de inmunoensaios, utilízase a especificidade da reacción de tipo antíxeno-anticorpo porque é doado utilizar como reactivo un anticorpo específico contra un antíxeno en masa. Alternativamente, se o propio analito é un anticorpo, pode utilizarse o seu antíxeno diana como o reactivo de unión.
Historia
Antes do desenvolvemento do ELISA, a única opción para realizar un inmunoensaio era o radioinmunoensaio, unha técnica que usaba anticorpos ou antíxenos marcados radioactivamente. No radioinmunoensaio, o sinal era proporcionado pola radioactividade, a cal indicaba se estaba presente na mostra un antíxeno ou anticorpo específico. O radioinmunoensaio foi descrito primeiro nun artigo científico de Rosalyn Sussman Yalow e Solomon Berson publicado en 1960.
Como a radioactividade supón unha ameaza potencial para a saúde, procurouse idear outra alternativa máis segura. Unha alternativa axeitada ao radioinmunoensaio sería aquela que substituíse o sinal radioactivo por outro non radioactivo. Cando certos encimas (como a peroxidase do ravo picante) reaccionan cos substratos apropiados (como ABTS ou TMB), prodúcese un cambio de cor, o cal se pode usar como sinal. Porén, o sinal ten que estar asociado coa presenza do anticorpo ou o antíxeno, o cal é a razón pola cal o encima ten que estar ligado a un anticorpo adecuado. Este proceso de ligamento foi desenvolvido independentemente por Stratis Avrameas e G. B. Pierce. Como é necesario eliminar calquera anticorpo ou antíxeno non unido mediante lavados, o anticorpo ou antíxeno ten que estar fixado á superficie dun recipiente contedor (para que non sexa tamén el arrastrado polo lavado); é dicir, debe prepararse o inmunosorbente. Leif Wide e Jerker Porath publicaron unha técnica que servía para conseguir iso en 1966.
miniatura|dereita|Preparación de análises nun laboratorio de ELISA.
En 1971, Peter Perlmann e Eva Engvall na Universidade de Estocolmo, Suecia, e Anton Schuurs e Bauke van Weemen nos Países Baixos publicaron artigos independentemente nos que sintetizaban este coñecemento nos métodos para realizar o EIA/ELISA.
O método tradicional do ELISA implica tipicamente reporteiros cromoxénicos e substratos que producen algún tipo de cambio de cor observable que indique a presenza do antíxedno ou analito. Técnicas máis novas similares ao ELISA usan reporteiros fluoroxénicos, electroquimioluminescentes, e de PCR cuantitativa para xerar sinais cuantificables. Estes novos reporteiros poden ter varias vantaxes, incluíndo maiores sensibilidades e a posibilidade de facer ensaios múltiples. En termos técnicos, estes novos tipos de ensaios non son estritramente ELISAs, xa que non están "ligados a encima", senón que están ligados a un reporteiro non encimático. Porén, como os principios xerais destes ensaios son basicamenrte similares, con frecuencia son agrupados na mesma categoría dos ELISAs.
En 2012 unha proba de ELISA baseado en encima ultrasensible que usaba nanopartículas como reporteiro cromoxénico conseguiu producir un sinal de cor visible a simple vista a partir da detección de simples attogramos (10−18g) do analito. Nos resultados positivos aparecía unha cor azul e nos negativos cor vermella. Esta detección só pode confirmar a presenza ou a ausencia de analito pero non a súa concentración real.
Tipos
ELISA directo esquerda|200px|miniatura|Diagrama do ELISA directo. Os pasos para realizar un ELISA directo son os seguintes:
Engádese unha solución tamponada do antíxeno que vai ser probado a cada pozo dunha placa de microtitradora (xeralmente úsanse placas de 96 pozos), e agárdase un tempo para que o antíxeno se adhira ao plástico por medio de interaccións de carga. Engádese ao pozo de reacción unha solución de proteínas non reactivas, como a albumina sérica bovina ou a caseína, para cubrir calquera superficie plástica no pozo que permaneza non recuberta de antíxeno. Adiciónase o anticorpo primario que leva un encima unido (conxugado), o cal se une especificamente ao antíxeno da proba que recobre o pozo. Engádese un substrato dese encima. Xeralmente é un substrato que cambia de cor cando se produce a reacción co encima. Canto maior é a concentración do anticorpo primario presente no soro, máis forte é o cambio de cor. Xeralmente utilízase un espectrómetro para dar os valores cuantitativos da forza da cor.
O encima actúa como un amplificador, xa que as moléculas de encima producirán moitas moléculas sinal aínda que só permanezan unidos uns poucos anticorpos ligados a encima. Coas limitación de sentido común, o encima pode continuar producindo cor indefinidamente, pero canto máis anticorpo haxa unido, máis rápido se producirá a cor. Unha importante desvantaxe do ELISA directo é que o método de inmobiliación do antíxeno non é específico, polo que cando se usa soro sanguíneo como fonte de antíxeno, todas as proteínas da mostra poden adherirse ao pozo da placa microtitradora, polo que pequenas concentracións de analito no soro deben competir con outras proteínas do soro á hora de unirse á superficie do pozo. O ELISA indirecto ou sandwich dá unha solución a este problema, ao usar un anticorpo de "captura" específico para o antíxeno que vai ser comprobado para retiralo da mestura molecular do soro.