En bioloxía molecular e bioloxía, un knock-in de xenes (ou knock-in) é un método de enxeñaría xenética que implica a substitución unha a unha de información de secuencia de ADN nun locus xenético ou a inserción de información de secuencia que non se encontraba nese locus. Normalmente isto faise en ratos, xa que a tecnoloxía para este proceso é máis refinada neles e hai un alto grao de complexidade de secuencias compartidas entre ratos e humanos. A diferenza entre a tecnoloxía knock-in e as técnicas transxénicas tradicionais é que un knock-in afecta a un xene nun locus específico, polo que é unha inserción dirixida a unha diana.

Un uso común da tecnoloxía knock-in é para a creación de modelos de enfermidades. É unha técnica grazas á que os investigadores poden estudar a función da maquinaria reguladora (por exemplo, promotores) que goberna a expresión do xene natural que está sendo substituído. Isto realízase observando o novo fenotipo do organismo en cuestión. Utilízanse BACs e YACs para que se poidan transferir grandes fragmentos.

Técnica

O knock-in de xenes orixinouse como unha pequena modificación da técnica orixinal do knockout desenvolvida por Martin Evans, Oliver Smithies e Mario Capecchi. Tradicionalmente, as técnicas knock-in fundamentábanse na recombinación homóloga para dirixir a substitución do xene diana, aínda que se desenvolveron tamén outros métodos que usan un sistema mediado por transposóns. As células nai embrionarias coa modificación de interese son implantadas despois nun blastocisto viable, que crecerá formando un rato quimérico maduro, no cal algunhas células teñen a información xenética das células do blastocisto orixinal e outras células teñen as modificacións introducidas nas células nai embrionarias. A descendencia que teñan despois eses ratos quiméricos terá o knock-in.

O knock-in de xenes permitiu por primeira vez facer estudos baseados en hipóteses sobre modificacións xénicas e os fenotipos resultantes. Por exemplo, poden inducirse mutacions no xene humano p53 por exposición ao benzo(a)pireno (BaP), e a copia mutada do xene p53 pode ser inserida en xenomas de rato. Os tumores pulmonares observados nos ratos knock-in ofrecen apoio á hipótese da carcinoxenicidade do benzo(a)pireno (un compoñente do fume do tabaco). Desenvolvementos máis recentes nas técnicas knock-in permitiron incorporar nos porcos un xene da proteína fluorescente verde inserida co sistema CRISPR/Cas9, que permite unhas insercións xénicas máis exactas e exitosas. A velocidade do knock-in de xenes mediado por CRISPR/Cas9 tamén permite xerar modificacións bialélicas nalgúns xenes e os fenotipos en ratos poden ser observados nunha soa xeración, o que é unha curta escala de tempo sen precedentes.

Comparación co knockout de xenes

A tecnoloxía knock-in é distinta da knockout porque a tecnoloxía knockout trata de eliminar por deleción parte da secuencia de ADN ou inserir información de secuencia de ADN irrelevante para interromper a expresión dun locus xenético específico. A tecnoloxía knock-in, por outra parte, altera o locus xenético de interese por medio dunha substitución unha a unha da información de secuencia de ADN ou pola adición de información de secuencia que non se encontrba en dito locus xenético. Un knock-in, por tanto, pode considerarse en xeral unha mutación de ganancia de función e un knockout unha mutación de perda de función, pero un knock-in de xenes pode tamén implicar a substitución dun locus xénico funcional por un fenotipo mutante que ten como resultado algunha perda de función.

Posibles aplicacións

Debido do éxito que están tendo os métodos de knock-in, pode pensarse para eles moitas aplicacións clínicas. O knock-in de seccións dun xene de inmunoglobulina humana en ratos xa permitiu que estes animais produzan anticorpos humanizados que son útiles terapeuticamente. Debería ser posible modificar células nai en humanos para restaurar a función dun xene diana en certos tecidos, por exemplo a posible corrección do xene mutante da cadea gamma do receptor de IL-2 en células nai hematopoéticas para estaurar o desenvolvemento dos linfocitos en persoas con inmunodeficiencia combinada grave ligada ao X.

Limitacións

Aínda que a tecnoloxía do knock-in demostrou ser poderosa para a xeración de modelos de enfermidades humanas e estudo de proteínas in vivo, existen aínda numerosas limitacións. Moitas destas son as mesmas que ten a tecnoloxía knockout. Primeiro, as combinacións de xenes knock-in levan a un crecemento da complexidade nas interaccións que teñen os xenes inseridos e os seus produtos con outras seccións do xenoma e poden, por tanto, conducir á aparición de máis efectos colaterais e fenotipos difíciles de explicar. Ademais, só foron suficientemente ben caracterizados uns poucos loci, como o locus ROSA26, onde poden utilizarse para o knock-in de xenes condicional; facendo combinacións de xene reporteiro e transxenes no mesmo locus problemático. As maiores desvantaxes de usar o knock-in de xenes en enfermidades humanas para xerar modelos é que a fisiololxía dos ratos non é idéntica á humana e as proteínas ortólogas humanas expresadas en ratos adoitan non reflectir totalmente o papel dun xene na patoloxía humana. Isto pode observarse en ratos producidos coa mutación da fibrose ΔF508 no xene CFTR, que explica máis do 70% das mutacións neste xene na poboación humana e orixina fibrose quística. Aínda que os ratos ΔF508 CF mostran as características de defectos de procesamento propias da mutación humana, non presentan os cambios na fisiopatoloxía pulmonar que se observan en humanos e non presentan virtualmente ningún fenotipo pulmonar. Estes problemas poden ser mitigados co uso de diversos modelos animais, e creáronse modelos de porcos (os pulmóns de porco teñen moitas semellanzas bioquímicas e fisioloxicas cos pulmóns humanos) nun intento de explicar mellor a actividade da mutación ΔF508.

Notas

Véxase tamén Outros artighos Knockout de xenes Knockdown de xenes Enxeñaría xenética Recombinación xenética Clonación molecular Plásmido Vector (bioloxía molecular)

Ligazóns externas Genetic methods, techniques and protocols Koch Institute for Integrative Cancer Research at MIT: Knockins and Knockouts UMass Profiles Research Networking Software: Gene Knock-In Techniques – unha ferramenta de software para a investigación http://www.transgenic.co.jp/en/products/mice-service/modified_mouse/knockin.php – construción e inserción de vectores e crianza de ratos

Categoría:ADN Categoría:Bioloxía molecular Categoría:Enxeñaría xenética Categoría:Biotecnoloxía Categoría:Técnicas de bioloxía molecular Categoría:Expresión xénica