miniatura|360px|O encima protease TEV contén un exemplo de tríade catalítica de residuos de aminoácidos (en vermello) no seu sitio activo. A tríade consiste en aspartato (ácido), histidina (base) e serina (nucleófilo). O substrato (en negro) é unido ao sitio de unión para orientalo cara ás proximidades da tríade. ()
Unha tríade catalítica é un conxunto de tres aminoácidos coordinados que se poden encontrar no sitio activo dalgúns encimas. As tríades catalíticas encóntranse máis comunmente en encimas hidrolases e transferases (por exemplo, proteases, amidases, esterases, acilases, lipases e β-lactamases). Unha tríade formada por ácido-base-nucleófilo é un motivo común para xerar un residuo nucleófilo para a catálise covalente. Os residuos de aminoácidos forman unha rede de relevo de carga para polarizar e activar o nucleófilo, o cal ataca o substrato, formando un intermediario covalente que é despois hidrolizado para liberar o produto e rexenerar o encima libre. O nucleófilo adoita ser unha serina ou cisteína, pero ocasionalmente é unha treonina ou mesmo unha selenocisteína. A estrutura tridimensional do encima fai que os residuos da tríade estean xuntos e cunha orientación precisa, incluso se ditos residuos están moi afastados na estrutura primaria do encima.
Ademais de teren unha evolución diverxente na función (e incluso no nucleófilo da tríade), as tríades catalíticas son algúns dos mellores exemplos de evolución converxente. As restricións químicas sobre a catálise conduciron á mesma solución catalítica que evolucionou independentemente en polo menos 23 superfamilias de proteínas. O seu mecanismo de acción é, en consecuencia, un dos mellores estudados en bioquímica.
Historia
Os encimas tripsina e quimotripsina foron purificados na década de 1930 por primeira vez. Na década de 1950 identificouse que unha serina na tripsina e quimotripsina era o nucleófilo catalítico (por modificación de diisopropil fluorofosfato). Resolveuse a estrutura da quimotripsina por cristalografía de raios X na década de 1960, que mostrou a orientación da tríade catalítica no sitio activo. Secuenciáronse outras proteases e aliñáronse descubrindo unha nova familia de proteases relacionadas, agora chamada familia S1. Simultaneamente, descubriuse que as estruturas das proteases non relacionadas evolutivamente papaína e subtilisina conteñen tríades análogas. O mecanismo de 'relevo de carga' (charge-relay) para a activación do nucleófilo polos outros membros da tríade propúxose a finais da década de 1960. A medida que se foron resolvendo máis estruturas de protease por cristalografía de raios X nas décadas de 1970 e 80, foron atopándose tríades homólogas (como a da protease TEV) e análogas (como a da papaína). O sistema de clasificación MEROPS nas décadas de 1990 e 2000 empezou a clasificar as proteínas en superfamilias de encimas estruturalmente relacionados e funciona como unha base de datos da evolución converxente das tríades nunhas 20 superfamilias. Comprender como as restricións químicas na evolución levaron a que se producise esta converxencia de tantas familias de encimas nas mesmas xeometrías de tríades foi un traballo que se desenvolveu ao longo da década de 2010.
Desde o seu descubrimento inicial, houbo un número crecente de investigacións detalladas sobre cal era o mecanismo catalítico exacto. Un asunto especialmente discutido durante os anos 90 e 2000 foi se os enlaces de hidróxeno de barreira baixa contribuían á catálise, ou se o enlace de hidróxeno ordinario era suficiente para explicar o mecanismo. A gran cantidade de traballos realizados sobre o relevo de carga, fixo que a catálise covalente utilizada polas tríades catalíticas sexa o mecanismo mellor coñecido en toda a bioquímica.
Función Os encimas que conteñen unha tríade catalítica úsana para un destes dous tipos de reaccións: para a rotura hidrolítica dun substrato (hidrolases) ou para transferir unha porción dun substrato sobre un segundo substrato (transferases). As tríades son un conxunto interdependente de residuos do sitio activo dun encima e actúan concertadamente con outros residuos (por exemplo, os do sitio de unión e do burato de oxianión) para conseguir unha catálise necleofílica. Estas tríades actúan xuntas para facer que o membro nucleófilo sexa altamente reactivo, xerando un intermediario covalente co substrato que é despois procesado ata a súa completa catálise.
Mecanismo
As tríades catalíticas realizan unha catálise covalente usando un residuo de aminoácido como nucleófilo. A reactividade do residuo nucleófilo increméntase polos grupos funcionais doutros membros da tríade. O nucleófilo é polarizado e orientado pola base, a cal á súa vez é estabilizada polo ácido.
A catálise realízase en dúas etapas. Primeiro, o nucleófilo activado ataca o carbono do carbonilo e forza o oxíxeno do carbonilo a aceptar un par electrónico, orixinando un intermediario tetraédrico. A acumulación de carga negativa neste intermediario é tipicamente estabilizada por un burato de oxianión do sitio activo. O intermediario despois colápsase de novo a carbonilo, exectando a primeira metade do substrato, pero deixando a segunda metade aínda unida covalentemente ao encima como un intermediario acil-encima. Aínda que a catálise xeral ácida para a rotura do primeiro e segundo intermediarios tetraédricos pode ocorrer pola vía mostrada no diagrama, as probas que apoian este mecanismo para a quimotripsina son controvertidas.
A segunda etapa da catálise é a resolución do intermediario acil-encima polo ataque dun segundo substrato. Se este substrato é a auga, entón o resultado é unha hidrólise; pero se é unha molécula orgánica, entón o resultado é a transferencia desa molécula ao primeiro substrato. O ataque por este segundo substrato forma un novo intermediario tetraédrico, que se resolve ao exectar o nucleófilo do encima, liberando o segundo produto e rexenerando o encima libre.
Identidade dos membros da tríade
miniatura|300px|Un sistema de relevo de carga de tríade catalítica como o que se adoita encontrar nas proteases. O residuo ácido (normalmente glutamato ou aspartato) alinea e polariza a base (xeralmente histidina), que activa o nucleófilo (que adoita ser serina ou cisteína, máis raramente treonina). A tríade reduce o pKa do residuo nucleófilo, o cal despois ataca o substrato. Un burato de oxianión xeralmente de amidas cargadas positivamente do esqueleto da molécula (ás veces de cadeas laterais) estabiliza a carga acumulada no estado de transición do substrato.
Nucleófilo
A cadea lateral do residuo nucleófilo realiza unha catálise covalente sobre o substrato. O par solitario de electróns presente no oxíxeno ou xofre ataca o carbono do carbonilo electropositivo. Os 20 aminoácidos que aparecen nas proteínas non conteñen ningún grupo funcional suficientemente nucleofílico para realizar moitas reaccións catalíticas difíciles. Que o nucleófilo estea incluído nunha tríade incrementa a súa reactividade para facilitar unha catálise eficaz. Os nucleófilos utilizados máis correntemente son o hidroxilo (OH) da serina e o tiol/ión tiolato (SH/S−) da cisteína. Alternativamente, as treonina proteases usan o hidroxilo secundario da treonina, aínda que debido aos impedimentos estéricos do seu grupo metilo extra da cadea lateral tales proteases usan a súa amida N-terminal como base, en vez douto aminoácido.
O uso de oxíxeno ou xofre como átomo nucleófilo causa pequenas diferenzas na catálise. Comparado co oxíxeno, o orbital d extra do xofre faino uns 0,4 Å máis grande e menos forte, o que lle permite formar enlaces máis longos (dC-X é 1,3 veces maior que dX-H), e dálle un menor pKa (5 unidades máis). A serina é, por tanto, máis dependente que a cisteína da orientación óptima dos membros da tríade ácido-base para reducir o seu pKa para conseguir unha desprotonación concertada coa catálise. O baixo pKa da cisteína supón unha desvantaxe na resolución do primeiro intermediario tetraédrico, xa que a reversión improdutiva do ataque nucleófilo orixinal é o produto da rotura máis favorable. A base da tríade está, por tanto, orientada preferentemente a protonar o grupo saínte amida para asegurar que é exectado para deixar o xofre do encima enlazado covalentemente ao N-terminal do substrato. Finalmente, a resolución do acil-encima (para liberar o C-terminal do substrato)) precisa serina para ser reprotonado, mentres que a cisteína pode saír como S−. estericamente o xofre da cisteína tamén forma enlaces máis longos e ten un radio de van der Waals maior e se muta a unha serina pode quedar atrapado en orientacións improdutivas no sitio activo.
Moi raramente utilízase como nucleófilo un átomo de selenio do aminoácido pouco común selenocisteína. O estado desprotonado do Se− está fortemente favorecido cando forma parte da tríade catalítica.
Base
Como ningún aminoácido natural é fortemente nucleofílico, a base dunha tríade catalítica polariza e desprotona o nucleoófilo para incrementar a súa reactividade. Ademais, protona o primeiro produto para axudar á expulsión do grupo saínte.
A base adoita ser a histidina, xa que o seu pKa permite unha efectiva catálise básica, a formación de enlaces de hidróxeno co residuo ácido e a desprotonación do residuo nucleóflo. As β-lactamases como a TEM-1 usan como base un residuo de lisina. Como o pKa da lisina é moi alto (pKa=11), un glutamato e outros varios residuos actúan como ácido para estabilizar o seu estado desprotonado durante o ciclo catalítico. As treonina proteases usan a súa amida N-terminal como base, porque o ateigamento estérico do metilo da súa treonina catalítica impide que outros residuos estean o suficientemente próximos.
Ácido
O membro ácido da tríade forma un enlace de hidróxeno co residuo básico. Isto aliña o residuo básico ao restrinxir a rotación da súa cadea lateral e polarízao ao estabilizar a súa carga positiva. Hai dous aminoácidos que teñen cadeas laterais ácidas a pH fisiolóxico (aspartato e glutamato) e por iso son os máis utilizados como membros ácidos da tríade. A protease de citomegalovirus usa un par de histidinas, unha como base, como é habitual, e outra como ácido. A segunda histidina non é un ácido tan eficaz coma os máis comúns aspartado ou glutamato, o que orixina unha menor eficacia catalítica. Nalgúns encimas o membro ácido da tríade é menos necesario e algúns actúan só como unha díade. Por exemplo, a papaína usa asparaxina como terceiro membro da tríade que orienta a base histidina, pero non actúa como ácido. De xeito similar, a protease do virus da hepatite A contén unha molécula de auga ordenada na posición onde debería haber un residuo ácido.
Exemplos de tríades miniatura|500x500px|Residuos de aminoácidos usados en diferentes combinacións en distintos encimas para constituír unha tríade catalítica para a hidrólise. Á esquerda están os membros da tríade nucleófilo, base e ácido. Á dereita están os diferentes substratos co enlace roto indicado por medio dun par de tesoiras. Nas beta-lactamas poden clivarse dous enlaces diferentes (1 na penicilina acilase e 2 na beta-lactamase).
Ser-His-Asp O motivo serina-histidina-aspartato é un dos motivos catalíticos mellor caracterizados en bioquímica. Esta tríade é exemplificada pola quimotripsina, un modelo de serina protease da superfamilia PA que usa a súa tríade para hidrolizar esqueletos peptídicos. O aspartato está unido por un enlace de hidróxeno por unha histidina, incrementando o pKa do seu nitróxeno do imidazol desde 7 ata arredor de 12. Isto permite que a histidina actúe como unha poderosa base xeral e active o nucleófilo serina. Tamén ten un burato de oxianión que consta de varias amidas do esqueleto peptídico que estabilizan a acumulación de carga nos intermediarios. A base histidina axuda ao primeiro grupo saínte ao doar un protón, e tamén activa o substrato hidrolítico auga ao retirar un protón cando o restante OH− ataca o intermediario acil-encima.