miniatura|250px|Produción dunha vacina de ADN. Unha vacina de ADN é un tipo de vacina que transfecta ás células dun organismo unha secuencia específica de ADN que codifica un antíxeno, como mecanismo para inducir unha resposta inmune.
As vacinas de ADN funcionan inxectando un plásmido preparado por enxeñaría xenética que contén a secuencia de ADN que codifica o(s) antíxeno(s) contra os cales se busca que se produza unha resposta inmune; deste xeito, as células producen directamente o antíxeno, o que causa unha resposta inmunolóxica protectora. As vacinas de ADN teñen vantaxes teóricas sobre as vacinas convencionais, incluíndo a "capacidade de inducir unha gama máis ampla de tipos de respostas inmunes". Probáronse varias vacinas de ADN para uso veterinario. Nalgúns casos, conseguiuse a protección contra enfermidades en animais, noutros non. As investigacións continúan sobre esta estratexia para doenzas virais, bacterianas e parasitarias en humanos, así como para cancros. En agosto de 2021, as autoridades da India deron unha aprobación de emerxencia para a ZyCoV-D, desenvolvida por Cadila Healthcare, que é a primeira vacina de ADN aprobada para o seu uso en humanos.
Historia As vacinas convencionais poden conter os antíxenos específicos dun patóxeno ou virus ou microorganismos atenuados que estimulan unha resposta inmune no organismo vacinado. As vacinas de ADN son un tipo de vacinas xenéticas porque conteñen unha información xenética (ADN ou ARN) que codifica a produción celular (biosíntese de proteínas) dun antíxeno. As vacinas de ADN conteñen ADN que codifica antíxenos específicos dun patóxeno. O ADN inxéctase no corpo e as células cáptano, e os seus procesos metabólicos normais sintetizarán proteínas baseadas na información xenética contida no plásmido captado. Como estas proteínas conteñen rexións con secuencias de aminoácidos que son características de bacterias ou virus, son recoñecidos como algo estraño e cando son procesadas polas células hóspede e exhibidas na súa superficie, o sistema inmunitario alértase, desencadeándose respostas inmunitarias. Alternativamente, o ADN pode ser encapsulado en proteínas para facilitar a súa entrada na célula.
En 1983, Enzo Paoletti e Dennis Panicali do Departamento de Saúde de Nova York idearon unha estratexia para producir vacinas de ADN recombinante usando a enxeñaría xenética para transformar a vacina da varíola ordinaria en vacinas que sirvan para previr outras enfermidades. Alteraron o ADN do virus da varíola das vacas inserindo un xene doutros virus (concretamente do virus Herpes simplex, do virus da hepatite B e do da gripe).US Patent 4722848 - Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus En 1993, Jeffrey Ulmer e colaboradores nos Merck Research Laboratories demostraron que a inxección directa en ratos dun plásmido de ADN que codificaba un antíxeno da gripe protexía os animais contra posteriores infeccións experimentais co virus da gripe. En 2016 empezou a probarse unha vacina de ADN para o virus Zika en humanos nos Institutos Nacionais da Saúde (NIH). O estudo estaba planeado para utilizar 120 suxeitos entre os 18 e os 35 anos de idade. Separadamente, Inovio Pharmaceuticals e GeneOne Life Science empezaton os tests dunha vacina diferente contra o virus Zika en Miami. A vacina dos NIH inxéctase na parte superior do brazo a alta presión. A fabricación das vacinas en volume suficiente aínda non estaba resolta en agosto de 2016. Os ensaios clínicos para as vacinas de ADN para previr o VIH/SIDA están en marcha.
En agosto de 2021, as autoridades indias deron unha aprobación de emerxencia para a vacina ZyCoV-D. Desenvolvida por Cadila Healthcare, é a primeira vacina de ADN contra a COVID-19.
Aplicacións En 2021 non se aprobara ningunha vacina de ADN para uso humano nos Estados Unidos. Poucos ensaios experimentais orixinaron unha resposta o suficientemente forte para protexer contra enfemidades e a utilidade da técnica aínda seguía sen estar probada en humanos.
Aprobouse unha vacina de ADN veterinaria para protexer os cabalos do virus do Nilo Occidental. Outra vacina contra o virus do Nilo Occidental probouse con éxito nos paxaros Turdus migratorius.
A inmunización por ADN está tamén investigándose como medio de desenvolver soros antivelenos. A inmunización por ADN pode utilizarse como plataforma tecnolóxica para a indución de anticorpos monoclonais.
Vantaxes
Non hai risco de infeccións. Presentación do antíxeno tanto por moléculas do complexo maior de histocompatibilidade da MHC clase I coma da MHC clase II. Polarizan a resposta das células T cara ao tipo 1 ou ao tipo 2. Resposta inmunitaria enfocada ao antíxeno de interese. Doada de desenvolver e producir. Estabilidade para o almacenamento e embarque. Bo custo-efectividade. Obvia a necesidade da síntese de péptidos, a expresión e purificación de proteínas recombinantes e o uso de adxuvantes tóxicos. Persistencia a longo prazo do inmunóxeno. A expresión in vivo asegura que a proteína lembra máis estreitamente a estrutura normal eucariota, con modificacións postraducionais acompañantes.
Desvantaxes Limitadas a inmunóxenos proteicos (non son útiles para antíxenos non baseados en proteínas como os polisacáridos bacterianos). Posible procesamento atípico de proteínas bacterianas e de parasitos. Posibilidade cando se usa a administración por spray nasal de que as nanopartículas de ADN do plásmido se transfecten a células non diana, como as células cerebrais. Contaminación cruzada cando se fabrican diferentes tipos de vacinas vivas nas mesmas instalacións.
Vectores plásmidos Deseño do vector As vacinas de ADN orixinan unha mellor resposta inmune cando se usan vectores de alta expresión. Estes son plásmidos que adoitan constar dun forte promotor viral para impulsar a transcrición e a tradución in vivo do xene (ou ADN complementario) de interese. Ás veces pode incluírse o intrón A para mellorar a estabilidade do ARNm e así incrementar a expresión da proteína. Os plásmidos tamén inclúen un forte sinal de terminación de poliadenilación/transcricional, como as secuencias de poliadenilación da hormona do crecemento bovina ou da beta-globulina de coello. Ás veces constrúense vectores policistrónicos (con múltiples xenes de interese) para expresar máis dun inmunóxeno ou para expresar un inmunóxeno e unha proteína inmunoestimulante.
Como o plásmido —que leva unha información xenética relativamente pequena de ata 200 Kbp— é o "vehículo" a partir do cal se expresa o inmunóxeno, é esencial optimizar o deseño do vector para unha expresión da proteína máxima. Unha forma de potenciar a expresión da proteína é optimizando o uso dos codóns de ARNm patóxenos polas células eucariotas. Os patóxenos adoitan ter diferentes contidos AT que os das especies diana, así que alterar a secuencia xénica do inmunóxeno para reflectir os codóns que máis habitualmente se usan nas especies diana pode mellorar a súa expresión.
Outra consideración é a elección do promotor. O promotor do SV40 era o que se usaba convencionalmente ata que se descubriu que os vectores co promotor do virus do sarcoma de Rous (RSV) tiñan moita maior taxa de expresión. Máis recentemente, a expresión e inmunoxenicidade aumentáronse moito en sistemas modelo co uso do promotor temperán inmediato de citomegalovirus (CMV), e un elemento transcricional que actúa en cis retroviral. Modificacións adicionais para mellorar as taxas de expresión son a inserción de secuencias amplificadoras, intróns sintéticos, secuencias líder tripartitas (TPL) de adenovirus e modificacións das secuencias de terminación transcricional e poliadenilación. Un exemplo de plásmido de vacina de ADN é pVAC, que usa o promotor do SV40.
Os fenómenos de inestabilidade estrutural son especialmente preocupantes na fabricación de plásmidos, vacinación de ADN e terapia xénica. As rexións accesorias que pertencen ao esqueleto molecular do plásmido poden sufrir unha ampla variedade de fenómenos de inestabilidade estrutural. Catalizadores ben coñecidos da inestabilidade xenética son as repeticións directas, inversas e en tándem, que son evidentes en moitos vectores de expresión e clonación dispoñibles comercialmente. Por tanto, a redución ou eliminación completa de secuencias no esqueleto molecular non codificantes estrañas reducirán intencionadamente a propensión de que teñan lugar eses eventos e en consecuencia o potencial recombinoxénico do plásmido global.
Mecanismo dos plásmidos
Unha vez que o plásmido se insire por si mesmo no núcleo da célula transfectada, como codifica a secuencia dun péptido dun antíxeno alleo, este exprésase na céula. O antíxeno alleo exhíbese na superficie da célula unido a moléculas do complexo de histocompatibilidade (MHC) das clases I e II. A célula presentadora do antíxeno migra entón aos ganglios linfáticos e presenta o péptido antixénico e a molécula coestimuladora á célula T, iniciando a resposta inmune.
Deseño do inserto da vacina
Os inmunóxenos poden enviarse a varios compartimentos celulares para mellorar as respostas de anticorpos ou de células T citotóxicas. Os antíxenos segregados ou unidos á membrana plasmática son máis efectivos na indución de respostas de anticorpo que os antíxenos citosólicos, mentres que as respostas de células T citotóxicas poden mellorarse etiquetando os antíxenos para a degradación citoplasmática e a entrada posterior na vía do complexo maior de histocompatibilidade de clase I. Isto realízase normalmente pola adición de sinais N-terminais de ubiquitina.
A conformación da proteína pode tamén afectar as respostas de anticorpos. As estruturas "ordenadas" (como as partículas virais) son máis efectivas que as desordenadas. As secuencias de minixenes (ou epítopos de MHC clase I) de diferentes patóxenos xeran respostas de células T citotóxicas contra algúns patóxenos, especialmente se tamén se inclúe un epítopo TH.
Entrega miniatura|As técnicas das vacinas de ADN e da terapia xénica son similares. As vacinas de ADN poden introducirse nos tecidos animais por moitos métodos. En 1999, as dúas estratexias máis habituais eran a inxección do ADN en soro fisiolóxico: usando unha agulla hipodérmica estándar ou unha entrega con canón de xenes. Documentáronse outras técnicas nos anos posteriores.
Inxección en soro fisiolóxico A inxección en soro fisiolóxico realízase normalmente por vía intramuscular no músculo esquelético, ou por vía intradérmica, entregando o ADN nos espazos extracelulares. Isto pode axudarse con 1) electroporación; 2) danando temporalmente as fibras musculares con miotoxinas como a bupivacaína; ou 3) usando solucións hipertónicas de soro fisiolóxico ou sacarosa. As respostas inmunitarias a este método poden ser afectadas por factores como o tipo de agulla, aliñamento da agulla, velocidade de inxección, volume de inxección, tipo de músculo, e idade, sexo e condición fisiolóxica do receptor.
Canón de xenes A entrega con pistola ou canón de xenes balisticamente (biolística) acelera o ADN do plásmido (ADNp ou pDNA) que foi absorbido en micropartículas de ouro ou volframio nas células diana, usando helio comprimido como acelerante.
Entrega na superficie de mucosas As alternativas inclúen a instilación en aerosol do ADN espido sobre as superficies mucosas, como as mucosas nasal e pulmonar, e administración tópica do ADNp no ollo e a mucosa vaxinal. A entrega na superfice de mucosas conseguiuse con preparacións de liposoma-ADN catiónicas, microesferas biodegradables, Salmonella atenuada, vectores de Shigella ou Listeria para a administración oral na mucosa intestinal e os vectores adenovirus recombinantes.
Vehículo polímero