Kaspaza-8 je protein kodiran genom CASP8 koji se nalazi na 2. kromosomu. To je aspartat-specifična cisteinska proteaza koja ima ulogu u apoptozi i imunološkoj signalizaciji. Ključna je u ekstrinzičnom putu apoptoze koji se aktivira putem nekoliko receptora, primjerice TNF receptor tipa 1. Pripada skupini inicijatorskih kaspaza koja imaju sljedeća svojstva:  Prve se aktiviraju nakon signala za apoptozu ili upalu  Sintetizirane su kao zimogeni – neaktivni prekursor enzima  Nakon određenih signala, regrutiraju se u velike multiproteinske komplekse zahvaljujući svojim prodomenama

Dimerizacijom i konformacijskim promjenama u kompleksu nastaje katalitički aktivni oblik kaspaze-8.

Aktivacija kaspaze-8 Za aktivaciju proteina kaspaze-8 nužna je prvotna aktivacija neaktivnog zimogena prokaspaze-8. Ovaj proces je sastavni dio ekstrinzičnog puta apoptoze te se mehanizam aktivacije odvija na sljedeći način:  Vezanje Fas liganda za receptor smrti na vanjskoj strani membrane  S unutarnje strane membrane Fas sa DD regijom (eng. death domain) veže adaptorni protein FADD  FADD svojom DED regijom (eng. death effector domain) privlači istoimenu regiju na prokaspazi-8 te zajedno čine DISC kompleks (eng. death inducing signaling complex)  Gomilanje molekula prokaspaze-8 unutar kompleksa što dovodi do dimerizacije

Pokreće se proces autoproteolize, svaka prokaspaza-8 cijepa se na dvije podjedinice – p10 i p18. Aktivna kaspaza-8 je p18-p10 heterotetramer sastavljen od dvije p10 i dvije p18 podjedinice.

Struktura kaspaze-8 mini|Struktura kaspaze-8 Kaspaza-8 sastoji se od 2 glavna dijela, N-terminalne prodomene i C-terminalne katalitičke domene. N-terminalna prodomena sadrži dvije tandemski povezane DED regije koje imaju nekoliko ključnih funkcija:  Omogućuje vezanje prokaspaze-8 za FADD protein  Sudjeluje u formiranju DISC kompleksa  Omogućuje aktivaciju kaspaze-8

C-terminalna katalitička domena je dio enzima odgovoran za proteolitičku aktivnost – cijepa ciljane proteine. Sastoji se od male (p10) i velike (p18) podjedinice, a sadrži šest β-niti koje čine centralnu β-ploču, nekoliko α-zavojnica te aktivno mjesto.

Aktivno mjesto nalazi se između p10 i p18 podjedinice i sadrži ključne aminokiseline cistein i histidin. One zajedno čine Cys-His katalitički par u kojem histidin služi kao aktivator cisteina koji potom napada peptidnu vezu supstrata.

Otkriće strukture kaspaze-8 Kaspaza-8 otkrivena je 1999. godine (W.Watt) kada je dobivena njezina prva struktura atomske rezolucije. To je omogućila metoda rendgenske kristalografije čiji je proces uključivao rekombinatnu ekspresiju kaspaze-8, pročišćavanje proteina, kristalizaciju enzima, difrakciju X-zraka na kristalima te računalnu rekonstrukciju elektronske gustoće i atomske strukture. Opisano je aktivno mjesto s katalitičkim cisteinima te su prikazane vodikove veze, razne konformacije i raspored podjedinica.

Funkcije kaspaze-8 Kaspaza-8 ima ključnu ulogu u regulaciji programirane stanične smrti, upale i imunoloških odgovora. Najpoznatija je po pokretanju ekstrinzičnog puta apoptoze, mehanizma koji uklanja oštećene, zaražene ili maligne stanice te doprinosi održavanju homeostaze tkiva.

Ekstrinzični put apoptoze započinje aktivacijom receptora smrti, poput Fas (CD95), TNFR1 ili TRAIL receptora, vanjskim signalima. To dovodi do stvaranja signalnog kompleksa koji inducira smrt stanice (DISC), a koji uključuje adaptorni protein FADD i prokaspazu-8. Unutar DISC-a dolazi do aktivacije prokaspaze-8, koja zatim aktivira izvršne kaspaze, uključujući kaspazu-3 i kaspazu-7. Ovi enzimi razgrađuju stanične komponente na kontroliran način, što rezultira programiranom staničnom smrću bez izazivanja upalnog odgovora.

Osim što potiče apoptozu, kaspaza-8 važan je inhibitor nekroptoze, izrazito upalnog oblika programirane stanične smrti. Kaspaza-8 sprječava nekroptozu cijepanjem proteina RIPK1, RIPK3 i CYLD, čime blokira signalni put RIPK3–MLKL. Kada je taj put aktivan, RIPK3 aktivira MLKL, koji se premješta na staničnu membranu i narušava njezin integritet. Posljedica toga je bubrenje i pucanje stanice te oslobađanje molekula povezanih s oštećenjem stanice (DAMP), što izaziva upalu. Važnost kaspaze-8 potvrđuje činjenica da miševi bez gena za kaspazu-8 ugibaju tijekom embriogeneze, dok istodobno uklanjanje RIPK3 ili MLKL omogućuje njihov normalan razvoj i preživljavanje.

Kaspaza-8 također sudjeluje u signalizaciji inflamazoma, unutarstaničnih proteinskih kompleksa koji prepoznaju infekcije, stanični stres i oštećenje tkiva. Inflamazomi održavaju ravnotežu između zaštitnog imunološkog odgovora i štetne upale regulirajući sazrijevanje citokina, piroptozu i privlačenje imunoloških stanica. Tijekom piroptoze kaspaza-8 može aktivirati inflamazome NLRP3, AIM2 i NLRP4, što dovodi do cijepanja proteina gasdermina GSDMD i GSDME. Njihovi N-terminalni fragmenti stvaraju pore u staničnoj membrani, omogućujući oslobađanje upalnih citokina, uključujući IL-1β i IL-18.  

Nadalje, kaspaza-8 jedan je od ključnih regulatora PANoptoze, upalnog puta stanične smrti koji objedinjuje apoptozu, piroptozu i nekroptozu. Koordiniranjem ovih mehanizama istodobno, PANoptoza predstavlja učinkovit obrambeni sustav protiv patogena koji mogu izbjeći pojedine oblike stanične smrti, čime osigurava snažnu imunološku zaštitu.

Metode kojima se dokazuje protein

Western blot Najprije se stanice u kojima želimo dokazati kaspazu-8 razore, zatim se proteini odvajaju elektroforezom i prebace na membranu gdje će se tretirati antitijelima specifičnim za kaspazu-8. Ovom metodom može se mjeriti razina inaktivnog i aktivnog oblika kaspaze-8.

Koimunoprecipitacija Ova metoda također koristi specifična antitijela za kaspazu-8, no razlika je to što se ovdje izdvajaju kompleksi kaspaze-8 i proteina s kojima je povezana. Upravo zbog toga ova metoda ne dokazuje samo prisutnost kaspaze-8, već pokazuje i njenu funkciju. Ovisno o tome s kojim proteinom je povezana može se pretpostaviti je li u pitanju normalna apoptoza stanice ili je došlo do aktivacije upalnog procesa.

Bolesti povezane s kaspazom-8

Upalne bolesti crijeva Za upalne bolesti crijeva najčešće se smatra da su to Crohnova bolest i ulcerozni kolitis. Budući da sam uzrok nastanka bolesti nije skroz razjašnjen, smatra se da su autoimune bolesti. Kaspaza-8 u normalnim količinama održava ravnotežu u crijevnom epitelu na način da kontrolira apoptozu stanica i sprječava nekroptozu i prekomjerne upalne signale. Kada dođe do mutacije ili smanjene aktivnosti kaspaze-8, kontrolirana apoptoza stanica prestaje normalno funkcionirati. Dolazi do aktivacije nekroptoze i izražene upale crijevnog tkiva.

Tumori Smanjena aktivnost kaspaze-8 može se vidjeti u hepatocelularnom karcinomu, raku dojke i Ewingovu sarkomu. Smanjena aktivnost je uzrokovana mutacijama, delecijama gena ili posttranslacijskim promjenama. Tumorske stanice zbog toga izbjegavaju programiranu staničnu smrt i postaju otpornije na kemoterapiju. Suprotno tome, kaspaza-8 može biti povišena u nekim tumorima, kao na primjer u kolorektalnom karcinomu, što dovodi do aktivacije upalnih puteva i pridonosi tumorskom rastu i otpornosti.

Izvori

Kategorija:Bjelančevine