bélyegkép|240px|Az EcoRV szerkezete és illeszkedése a DNS kettős szálához A restrikciós endonukleáz (vagy restrikciós enzim) olyan enzim, amely képes felismerni egy rövid nukleotidszekvenciát a kétszálú DNS-en belül és azon a helyen – vagy a közelében – elvágja a DNS-t.Roberts RJ (November 1976). "Restriction endonucleases". CRC Crit. Rev. Biochem. 4 (2): 123–64. Ezeket az enzimeket baktériumok és archebaktériumok termelik és a vírusfertőzés elleni védekezésben játszanak szerepet.Arber W, Linn S (1969). "DNA modification and restriction". Annu. Rev. Biochem. 38: 467–500 A sejten belül azokat az idegen nukleinsavakat vágják el, melyekben az általuk felismert szekvencián egy metiláz enzim korábban nem helyezett el egy metilcsoportot (és ezáltal korlátozzák, restrikció alá helyezik a vírusszaporodást). A két folyamat együtt alkotja a restrikciós modifikációs rendszert.

Eddig több mint 3000 restrikciós endonukleázt tanulmányoztak részletesen és közülük mintegy 600 kereskedelmi forgalomba is került.Roberts RJ, Vincze T, Posfai J, Macelis D. (2007). "REBASE—enzymes and genes for DNA restriction and modification". Nucleic Acids Res 35 (Database issue): D269–70. A molekuláris biológiai laboratóriumok gyakran használják ezeket az enzimeket, többek között a klónozás és a génsebészet alapvető eszközei.

Felfedezése Az 1950-es évek elején fedezte fel Salvador Luria és Giuseppe Bertani, hogy a λ-fág egyes Escherichia coli törzsekben jól szaporodik, míg másokban sokkal kevésbé.Luria SE, Human ML (October 1952). "A nonhereditary, host-induced variation of bacterial viruses". J. Bacteriol. 64 (4): 557–69. Bizonyos törzsek képesek voltak csökkenteni a vírus fertőzőképességét, amely más törzsekbe való átvitel után is megmaradt. Az 1960-as években Werner Arber és Matthew Meselson kimutatta, hogy a restrikciós hatás a fág DNS-ének feldarabolása miatt következik be és az ezt végző enzimet restrikciós endonukláznak (a nukleinsav közepén vágó enzimnek) nevezték el.Meselson M, Yuan R (March 1968). "DNA restriction enzyme from E. coli". Nature 217 (5134): 1110–4. Ezek az endonuklázok az I-es típushoz tartoztak, amelyek a felismerőhely közelében random módon vágják el a DNS-t. 1970-ben Hamilton O. Smith, Thomas Kelly és Kent Welcox felfedezte az első II-es típusú enzimet, a Haemophilus influenzae HindII fehérjéjét, amely a felismerőhelyen belül vágott.Smith HO, Wilcox KW (July 1970). "A restriction enzyme from Hemophilus influenzae. I. Purification and general properties". J. Mol. Biol. 51 (2): 379–91. Daniel Nathans mutatta ki, hogy a restrikciós endonukleázok specifikus darabokra vágják az SV40 (simian virus 40) DNS-ét, amiket aztán gélelektroforézissel szét lehet választani.Danna K, Nathans D (December 1971). "Specific cleavage of simian virus 40 DNA by restriction endonuclease of Hemophilus influenzae". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 68 (12): 2913–7. A módszerrel el lehetett kezdeni a vírusgenom feltérképezését. Werner Arber, Daniel Nathans, és Hamilton O. Smith 1978-ban orvosi Nobel-díjat kapott a restrikciós enzimekkel végzett munkájukért.

A felismerőhely A restrikciós endonukleázok egy bizonyos rövid nukleotidmintázatot ismernek fel a DNS-en belül. A felismerőhely általában 4-8 nukleotid hosszúságú és sok esetben palindrom, vagyis a bázisok sorrendje ugyanaz előre és visszafelé olvasva is. A palindrom szakasz lehet tükörszerű, amikor ugyanazon a szálon lehet visszafelé is elolvasni a szekvenciát (például GTAATG). Gyakoribb azonban, hogy az ismétlődés megfordított, vagyis a komplementer DNS-szálon lehet olvasni fordított irányban (például GTATAC, a bázispárosodásnak megfelelően a komplementer szálon visszafelé olvasva szintén GTATAC lesz).

Egyes endonukleázok „tompa” végű fragmenteket produkálnak, mint például a SmaI:

bélyegkép|70px|bal

A laboratóriumok inkább olyan enzimeket használnak amelyek „ragadós” végű darabokat produkálnak, mint az EcoRI: bélyegkép|70px|bal

Melegítés hatására a szálak szétválaszthatók és utána egy másik, ugyanilyen enzimmel elvágott DNS-el összehibridizálhatóak. Az elvágott szálak pedig a DNS-ligáz enzim segítségével összeforraszthatóak.

Azokat a restrikciós endonuklázokat, amelyeknek ugyanaz a felismerőhelyük neoskizomereknek nevezik. Azokat pedig, amelyeknek a hasítóhelyük is megegyezik, izoskizomernek.

A restrikciós endonukleázok elnevezése a következő szabály szerint áll össze: első betűje annak a baktérium genusának első betűje, amelyikből izolálták; utána a fajnév első két betűje; a törzs – ha van – első betűje, és végül egy sorszám. Az EcoRI például az Escherichia coli RY13 törzséből elsőként izolált enzim.Smith HO, Nathans D (December 1973). "Letter: A suggested nomenclature for bacterial host modification and restriction systems and their enzymes". J. Mol. Biol. 81 (3): 419–23.

Típusok A baktériumokban előforduló restrikciós endonukleázokat négy csoportba (I, II III, és IV) sorolják, szerkezetük, kofaktorigényük, felismerőhelyük és hasítóhelyük alapján:Bickle TA, Krüger DH (June 1993). "Biology of DNA restriction". Microbiol. Rev. 57 (2): 434–50.

I. típus, a felismerőhelyen kívül vágja a DNS-t; működéséhez ATP-re és S-adenozil-L-metioninra van szüksége; hasító és metiláló funkcióval is rendelkezik. II. típus, a felismerőhelyen belül vagy hozzá nagyon közel vág; magnéziumionra van szüksége, metilázfunkcióval nem rendelkezik. III. típus, a felismerőhely közelében vág; szüksége van ATP-re (de nem hidrolizálja el); az S-adenozil-L-metionin stimulálja a reakciót, de nem feltétlenül szükséges; egy komplexben van a metilázzal. IV. típus, módosított (vagyis metilált, hidroximetilált vagy glükozil-hodroximetilált) DNS-t vág.

Mesterséges restrikciós enzimek A természetes enzimek szerkezetének kutatása lehetővé tette mesterséges endonukleázok létrehozását. Ilyenkor egy DNS-kötő domént egy nukleázdoménnel (például a FokI hasítódoménját) kombinálnak össze.Kim YG, Cha J, Chandrasegaran S (February 1996). "Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (3): 1156–60. Az ilyen enzimek specificitása tetszés szerint módosítható, akár 36 bázispár hosszú szekvenciát is felismerhetnek.

Felhasználás A ragadós véget produkáló restrikciós enzimeket különböző eredetű DNS-szálak egymáshoz illesztésére lehet felhasználni, így főleg a génklónozási (nem összetévesztendő a teljes szervezet klónozásával) és génsebészeti kísérletekben. Erre a célra speciális plazmidvektorokat fejlesztettek ki, melyeken több, gyakran használt enzim felismerőhelye is megtalálható. Mind a plazmidot, mind az átviendő DNS-szakaszt restrikciós enzimmel kezelik, összekeverés után felmelegítéssel elválasztják egymástól a szálakat, majd visszahűtés után (miután a kétszálú DNS-konformáció helyreállt) ligáz enzimmel összekötik az endonukleáz által elvágott szálat.Geerlof A. "Cloning using restriction enzymes". European Molecular Biology Laboratory - Hamburg.

A restrikciós endonukleázok egyes pontmutációk gyors és olcsó felismerésére is alkalmasak, amennyiben a mutáció elront egy felismerőhelyet (vagy létrehozza azt). Ilyenkor az endonukleázos emésztés után az eredeti szakasz a gélelektroforézis során két rövidebb, míg a mutáns verzió egyetlen, hosszabb csíkot fog mutatni.Wolff JN, Gemmell NJ (February 2008). "Combining allele-specific fluorescent probes and restriction assay in real-time PCR to achieve SNP scoring beyond allele ratios of 1:1000". BioTechniques 44 (2): 193–4, 196, 199.

Restrikciós endonukleázokat használnak a törvényszéki orvostan által is alkalmazott DNS-ujjlenyomat meghatározásánál is. Az egyes hasítóhelyek közötti távolság egyénenként eltérő lehet, ami két minta közötti azonosság vagy akár rokonság gyors meghatározását teszi lehetővé.

A molekuláris biológia korai időszakában, amikor még nem álltak rendelkezésre olcsó szekvenálási módszerek, a restrikciós enzimeket a kisebb (főleg vírus-) genomok feltérképezésére is használták.

Példák Az alábbi táblázatban néhány restrikciós enzim, felismerő- és hasítóhelyük látható:Roberts RJ (January 1980). "Restriction and modification enzymes and their recognition sequences". Nucleic Acids Res. 8 (1): r63–r80.

Enzim Eredet Felismerőhely HasítóhelyEcoRIEscherichia coli 5'GAATTC 3'CTTAAG 5'---G AATTC---3' 3'---CTTAA G---5'EcoRIIEscherichia coli 5'CCWGG 3'GGWCC 5'--- CCWGG---3' 3'---GGWCC ---5'BamHIBacillus amyloliquefaciens 5'GGATCC 3'CCTAGG 5'---G GATCC---3' 3'---CCTAG G---5'HindIIIHaemophilus influenzae 5'AAGCTT 3'TTCGAA 5'---A AGCTT---3' 3'---TTCGA A---5'TaqIThermus aquaticus 5'TCGA 3'AGCT 5'---T CGA---3' 3'---AGC T---5'NotINocardia otitidis 5'GCGGCCGC 3'CGCCGGCG 5'---GC GGCCGC---3' 3'---CGCCGG CG---5'HinfIHaemophilus influenzae 5'GANTCA 3'CTNAGT 5'---G ANTC---3' 3'---CTNA G---5'Sau3AStaphylococcus aureus 5'GATC 3'CTAG 5'--- GATC---3' 3'---CTAG ---5'PvuII*Proteus vulgaris 5'CAGCTG 3'GTCGAC 5'---CAG CTG---3' 3'---GTC GAC---5'SmaI*Serratia marcescens 5'CCCGGG 3'GGGCCC 5'---CCC GGG---3' 3'---GGG CCC---5'HaeIII*Haemophilus aegyptius 5'GGCC 3'CCGG 5'---GG CC---3' 3'---CC GG---5'HgaIHaemophilus gallinarum 5'GACGC 3'CTGCG 5'---NN NN---3' 3'---NN NN---5'AluI*Arthrobacter luteus 5'AGCT 3'TCGA 5'---AG CT---3' 3'---TC GA---5'EcoRV*Escherichia coli 5'GATATC 3'CTATAG 5'---GAT ATC---3' 3'---CTA TAG---5'EcoP15IEscherichia coli 5'CAGCAGN25NN 3'GTCGTCN25NN 5'---CAGCAGN25 NN---3' 3'---GTCGTCN25NN ---5'KpnIKlebsiella pneumoniae 5'GGTACC 3'CCATGG 5'---GGTAC C---3' 3'---C CATGG---5'PstIProvidencia stuartii 5'CTGCAG 3'GACGTC 5'---CTGCA G---3' 3'---G ACGTC---5'SacIStreptomyces achromogenes 5'GAGCTC 3'CTCGAG 5'---GAGCT C---3' 3'---C TCGAG---5'SalIStreptomyces albus 5'GTCGAC 3'CAGCTG 5'---G TCGAC---3' 3'---CAGCT G---5'ScaI*Streptomyces caespitosus 5'AGTACT 3'TCATGA 5'---AGT ACT---3' 3'---TCA TGA---5'SpeISphaerotilus natans 5'ACTAGT 3'TGATCA 5'---A CTAGT---3' 3'---TGATC A---5'SphIStreptomyces phaeochromogenes 5'GCATGC 3'CGTACG 5'---GCATG C---3' 3'---C GTACG---5'StuI*Streptomyces tubercidicus 5'AGGCCT 3'TCCGGA 5'---AGG CCT---3' 3'---TCC GGA---5'XbaIXanthomonas badrii 5'TCTAGA 3'AGATCT 5'---T CTAGA---3' 3'---AGATC T---5' Kódok: * = tompa vég N = bármilyen, C,G,T vagy A nukleotid W = A vagy T

Jegyzetek

Fordítás

Kategória:Molekuláris biológia Kategória:Enzimek