A szerkezetszámolás az NMR-alapú fehérjeszerkezet-meghatározás egyik fontos lépése. 2002-ben Kurt Wüthrich Kémiai Nobel-díjat kapott „olyan módszerek fejlesztéséért, melyek segítségünkre lehetnek a biológiai makromolekulák azonosításában és szerkezetük vizsgálatában”.
A fehérjék NMR-spektroszkópiával történő térszerkezet-vizsgálata mára már krisztallográfiai felbontás elérésére is képes. A PDB (Protein Data Bank) adatbázisban az NMR-szerkezetek száma egyre nő (összesen 141 010 szerkezet, ebből 126 240 röntgenkrisztallográfiai módszerekkel meghatározott, 12 225 pedig NMR-spektroszkópiai megközelítéssel készült). A módszerek korlátját a fehérje molekulatömege jelenti. A szerkezetszámoláshoz kísérletileg meghatározott kényszerfeltételekre van szükség, ezeket több csoportba sorolhatjuk; leggyakrabban a távolsági és szög kényszerfeltételeket használják.
Távolsági kényszerfeltételek Egy homonukleáris 2D NOESY spektrumban megjelenő keresztcsúcs két atommag térbeli közelségére utal, így minden csúcshoz tartozik egy maximális távolság az atommagok között, általában 1,8–6 A közötti érték. Egy NOESY csúcs intenzitása a távolság hatodik hatványával fordítottan arányos, ezért a távolság a csúcsintenzitás alapján meghatározható. Az intenzitás-távolság összefüggés nem pontos, így általában egy távolságtartományt használunk.
Kulcsfontosságú a NOESY jelek hozzárendelése a megfelelő atommaghoz a kémiai eltolódás alapján. Manuálisan végezve ez egy rendkívül munkaigényes feladat, mivel a fehérjék – méretüktől függően - több ezer NOESY jellel rendelkezhetnek. Néhány számítógépes program, mint például a PASD,/XPLOR-NIH az UNIO, a CYANA, az ARIA/CNS és az AUDANA/PONDEROSA-C/S az integratív NMR-platformban automatikusan elvégzi ezt a feladatot a manuálisan megadott csúcslisták alapján, szerkezetszámolással. Az iteratívan finomított csúcslistán alapuló fáradságos munka mellőzésével, direkt hozzáférést a NOESY adatokhoz eddig csak az XPLOR-NIH –be implementált PASD algoritmus, az UNIO szoftvercsomagba implementált ATNOS/CANDID, valamint a PONDEROSA-C/S adott, és ezáltal objektív és hatékony NOESY spektrum analízist tettek lehetővé.
A hibalehetőségek száma átlapoló jelek esetében megnő, ezért a nagyobb méretű fehérjék esetében (> 50 aminosav) már izotópjelöléssel érdemes próbálkozni. A 15N és 13C editált NOESY mérések segítenek a proton dimenzióban átfedő csúcsok azonosításában. Ez gyorsabb és megbízhatóbb asszignációt tesz lehetővé, ezáltal jobb szerkezetek számolhatók.
Szög kényszerfeltételek A távolsági kényszerfeltételek mellett a kémiai kötések torziós szögeihez, tipikusan a ψ és φ szögekhez is megadhatók kényszerfeltételek. Az ehhez kapcsolódó módszerek azon a tényen alapulnak, hogy az α szénatom geometriája befolyásolja a csatolási állandókat és a kémiai eltolódásokat. Egy lehetséges megközelítés a Karplus-egyenlet használata, mellyel a 3JHH(NH-CH) háromkötéses csatolási állandókból kaphatók szögkényszerek.
Egy másik megközelítés (TALOS+) szerint a kémiai eltolódásokból lehet ilyen kényszerfeltételeket meghatározni.
Orientációs kényszerfeltételek A vizsgálandó molekulák egy mintában részlegesen rendeződhetnek a külső mágneses térhez képest, ha változtatjuk a minta tulajdonságait. Ún. rendezett közegként széles körben alkalmazzák a bakteriofágokat vagy bicellákat, illetve a minta elkészítését egy nyújtott poliakrilamid gélben. Ez olyan helyi környezetet teremt, mely nem gömbszerű molekulák bizonyos rendeződését segíti elő. Oldatfázisú NMR-ben az atommagok közötti dipoláris csatolások a molekulák bukdácsolása miatt kiátlagolódnak, ám az orientáció csekély populációtöbblete azt eredményezi, hogy maradék dipoláris csatolások (RDC) figyelhetők meg; ezáltal egy adott globális koordináta-rendszerben információ nyerhető a kötésvektorok helyzetéről. A gyakorlatban leginkább az N-H vektor orientációjának vizsgálata terjedt el. Ebben az esetben az RDC értékek az izotróp és rendezett közegben felvett 1H, 15N-HSQC spektrumokból határozhatók meg. Izotróp közegben 1JNH, rendezett közegben 1JNH+RDC csatolások értéke mérhető, ezek különbsége adja meg a vizsgálandó paramétert. Az RDC paraméter értékeket korábban a már meghatározott szerkezetek finomítására használták, de kísérletet tettek kizárólag RDC feltételeken alapuló de novo szerkezet-meghatározásra is.
Szerkezetszámolás bélyegkép|Az NMR-spektroszkópiás szerkezet-meghatározás szerkezetek sokaságát eredményezi. A szerkezetek csak akkor konvergálnak, ha az adatok megfelelnek egy specifikus feltekeredés kijelölésére. Ezekben a szerkezetekben ez csak a szerkezet egy részére igaz. PDB entry 1SSU A kísérletileg meghatározott kényszerfeltételek a szerkezetszámolási folyamat bemeneti információjaként használhatók. Az XPLOR-NIH, CYANA vagy GeNMR programokat használó kutatók arra törekednek, hogy az eddig felsoroltak közül minél több kényszerfeltétel teljesüljön. Az algoritmusok ezeket a kényszerfeltételeket és az általános fehérjetulajdonságokat energiatagokká alakítják át, majd próbálják minimalizálni ezt az energiát. A folyamat eredményeként szerkezetek sokaságát kapjuk, amik konvergálnak, ha az adatok megfelelőek egy bizonyos szerkezet kijelölésére.
A szerkezet validálása Fontos megjegyezni, hogy a kapott szerkezetsokaság egy „kísérleti modell”, azaz egy bizonyos fajtájú kísérleti adat ábrázolása. Ennek a ténynek az elismerése elengedhetetlen, mert azt jelenti, hogy a modell jó vagy rossz megjelenítése is lehet a kísérleti adatoknak. Általában a modell minősége a kísérleti adatok minőségén és mennyiségén múlik, illetve ezen adatok megfelelő értelmezésén.
Fontos emlékeznünk arra is, hogy minden kísérlet hibákkal jár. Véletlenszerű hibák befolyásolják a szerkezetek reprodukálhatóságát és precizitását. A szisztematikus hibák a modell pontosságára vannak hatással. A precizitás a mérés reprodukálhatóságának mértékét jelenti, és gyakran az azonos körülmények között megismételt mérésből kapott adatkészlet eltérésével fejezik ki. A pontosság azt adja meg, milyen mértékben közelíti meg egy mérés a „valódi” értékét.
Egy fehérjemodell annál pontosabb, minél jobban illeszkedik a tényleges molekulához, amit megjelenít, és annál precízebb, minél kisebb az atomok helyzetének bizonytalansága. Gyakorlatban nincs olyan „standard molekula”, amihez a fehérjemodelleket hasonlítani lehetne, így a pontosságot a modell és a kísérleti adatok közötti egyezés mértékével jellemzik. Történetileg az NMR-spektroszkópia segítségével meghatározott szerkezetek általában rosszabb minőségűek, mint a röntgenkrisztallográfiával meghatározottak. Ennek részben az az oka, hogy kevesebb adatot tartalmaznak. Emiatt elterjedtté vált az NMR-szerkezeti sokaságok minőségének meghatározására, hogy összevetették ugyanazon fehérje röntgenszerkezetével. Ez azért jelenthet problémát, mert előfordulhat, hogy a röntgenszerkezet nem áll rendelkezésre, és mivel a fehérjék oldatban flexibilis molekulák, egyetlen szerkezettel jellemezni egy fehérjét az egyes atomok belső változásainak alul-becsléséhez vezethet. Egy konformációkészlet NMR-spektroszkópia segítségével vagy röntgenkrisztallográfiával meghatározva ezért jobb megjelenítése lehet egy fehérje kísérleti adatainak, mint egy konformáció.
Egy modell felhasználhatóságát részben a modell pontosságának és precizitásának mértéke adja meg. Egy pontos modell rossz precizitással felhasználható fehérjék evolúciós kapcsolatainak tanulmányozásához, míg a gyógyszertervezéshez precíz és pontos modellek szükségesek. Egy modell, ami nem pontos, a precizitásától függetlenül nem lesz túl hasznos.
Mivel a fehérjeszerkezetek kísérleti modellek hibákkal, nagyon fontos, hogy detektálni tudjuk ezeket a hibákat. Ez a folyamat a validálás. Számos módszer létezik validálásra, néhány statisztikus, mint a PROCHECK és a WHAT IF, míg mások fizikai szabályokon alapulnak, mint a CheShift, vagy e kettőnek keverékei, mint a PSVS.
Jegyzetek
Kategória:Élettan