A DNS-polimeráz δ katalitikus alegysége (DPOD1, POLD1) a DNS-polimeráz δ POLD1 gén által kódolt része. A DNS követő szálának szintéziséért felel, de a vezető szálon is végez bizonyos módosításokat. A POLD1 a DNS-polimeráz- és az exonukleázdoméneket is tartalmazza, fontos második funkciót biztosítva az ellenőrzésben a DNS-szintézis pontosságának biztosításához és sok replikációval összefüggő DNS-javításhoz DNS-károsodás után.
A POLD1 aktivitását gátló csíravonal-mutációk számos öröklött rákhajlamban, bizonyos sporadikus rákokban és egy idő előtti öregedést, mandibularis hipopláziát, siketséget, progeroid jellemzőket és lipodisztrófiát okozó fejlődési szindrómában érintettek. A POLD1 tanulmányai a genomstabilitás fenntartását hangsúlyozzák ki a tumorigenezis korlátozásához. Nem ismert, hogy a POLD1 hibái okozta megnövekedett tumorigenezist a megnövekedett báziscsereszám vagy a villaösszeomlás és a kettősszál-törések (DSB) létrejötte okozza. 2012-es elemzések a POLD1 fontos funkcióiról számoltak be. Felfedezés Az első DNS-polimerázt, a DNS-polimeráz I-et Arthur Kornberg és társai fedezték fel 1956-ban. 1976-ban Byrnes et al. felfedeztek egy harmadik DNS-polimeráz-aktivitást az emlőssejtekben, a polimeráz δ-t. Ezt nyulak eritroid hiperpláziás csontvelőjében fedezték fel, és 3’–5’-exonukleázként is működő DNS-polimerázként jellemezték. Ezen ellenőrző funkciót a DNS-polimerázok esetén 4 évvel korábban Kornberg és Brutlag írták le Escherichia coliban. A humán DNS Pol δ heterotetramer. 4 alegysége a POLD1 (p125), a POLD2 (p50), a POLD3 (p66) és a POLD4 (p12), az alternatív nevek a molekulatömeget jelzik kDa-ban. A katalitikus egységet a 125 kDa-os fehérjeként azonosították aktivitásfestéssel 1991-ben. Több csoport függetlenül klónozta a humán és az egér-POLD1-cDNS-t. Számos forrásból, például borjú-csecsemőmirigyből, humán méhlepényből és HeLa-sejtekből való kimutatása után kimutatták, hogy a DNS-javításban fontos. Gén A DNS-polimeráz δ1, katalitikus alegység és a POLD1 a gén neve, illetve jele, melyet a Humángenom-szervezet (HUGO) Génnevezéktani Bizottsága (HGNC) nevezett ki. A POLD1 további nevei CDC2, MDPL, POLD és CRCS10, mintegy 34 kb hosszú, és a 19. kromoszóma q13.33 sávján van. Pontos helye a GRCh38.p2-ben az . és az . bázispár közt van a 19. kromoszómán. Egérortológja az egér 7. kromoszómáján van. A fő humán POLD1-átirat (NM_002691.3) 27 exont tartalmaz és a p125 (más néven A) alegység 1107 aminosavját kódolja. Egy hosszabb izoforma ismert az 592. aminosav után kereten belüli 26 aminosavas inzertációval (NP_001295561.1). Egy pszeudogén (LOC100422453) ismert a 6. kromoszóma q-karján. Az 1. táblázat a humán, egér-, Saccharomyces cerevisiae- és Schizosaccharomyces pombe-Polδ alegységeinek génneveit tartalmazza.
A POLD1 promoter a sejtciklus során szabályozva van, a POLD1-mRNS expressziója a G1/S fázis végén éri el maximumát a DNS-replikáció során. A POLD1-promoter GC-gazdag és nincs TATA boxa. E GC boxot tartalmazó promotert az Sp1 és kapcsolódó transzkripciós faktorok, például az Sp3 szabályozzák, amit 11 bázispáros ismétlődő kötőszekvenciák mediálnak. A promoter E2F-szerű szekvenciát tartalmaz a fő transzkripciókezdő hely közelében. Egy másik szabályzóelem, a sejtcikluselem/sejtciklusgén-homológ régió a kezdet után található, és a POLD1 transzkripciójához kell a G2/M fázis során az E2F1 és p21 által. A p53 a POLD1-transzkripciót közvetett p21-dependens p53-p21-DREAM-CDE/CHR-út-aktivációval szabályozza. Egy tanulmány szerint a p53 tumorszupresszor az Sp1-gyel verseng a POLD1-promoterhez való kötésért. A miR-155 miRNS a POLD1-et közvetetten, a FOXO3A szupressziójával gyengíti, melynek feltételezett kötőhelyei vannak a POLD1-promoterben (RTMAAYA, válaszelem). Fehérje bélyegkép|1. ábra: A Polδ-funkció sematikus ábrája a DNS-replikációsvillánál. A Polδ-komplex (p125, p50, p66, p12) a replikációs villával asszociál. Az ssDNS-ek replikációs fehérje A1-gyel (RPA, rózsaszín) asszociálnak. A Polα a primázhoz kötve elindítja a követőszál-szintézist (kék vonal), itt RNS-primert bővít a Polα, majd a Polδ. A vezető szál (fekete) a Polε-t és a 4 alegységből (Sld5, Psf1, Psf2, Psf3) álló GINS1-et (go-icsi-ni-szan) mutatja. A GINS kölcsönhat a Polε-nal a DNS-szintézis indításához. 2014-es tanulmányok szerint a Polδ a vezető szál szintézisében is fontos. A PCNA (piros gyűrű) mindkét polimerázt stimulálja. Az RFC–RPA komplex DNS-kapcsot tölt a PCNA-nak. A követő szál rövid Okazaki-töredékekben jön létre, melyeket ligázok kapcsolnak össze. A polimerázok által nem javított replikációs hibákat a posztreplikációs hibajavítás javítja. A POLD1 a DNS-polimeráz α-hoz és ε-hoz hasonló B-családbeli szerkezetű. A humán POLD1 feltételezett N-terminális magi lokalizációs jellel rendelkezik (4–19. aminosav). A 304–533. aminosavak az exonukleáz- (2. ábra), az 579–974. a polimerázdomént adják. Az exonukleáz DEDDy-típusú DnaQ-szerű domén, mely a DNS-polimerázok B-családjában gyakori. E domén β-hajtűvel rendelkezik, mely segít a polimeráz- és exonukleáz-aktívhelyek közti váltásban hibás nukleotidbeillesztéskor.
A polimerázdomén legállandósultabb motívumai az A és a C. Ezek 2 katalitikus aszparaginsavat (DXXLYPS, D602; DTDS, D757) tartalmaznak, melyek az aktív helyen kalciumot kötnek. Az A motívum 11 aminosavból áll, melyek a nukleotidbeillesztésben és a foszfodiészter-kötés létrehozásában fontosak.
Az Y701 az Y567-hez hasonlóan működik az RB69 bakteriofág ortológjában sztérikus cukorkapuként, mely megakadályozza a ribonukleotid-bekerülést. A 711–715. aminosav LXCXE motívuma a pRB-kötést mediálja a G1 fázis során. A polimerázdomén állandósult KKRY motívummal (806–809) is rendelkezik, mely a kötéshez és a katalitikus funkcióhoz szükséges. A POLD1 a nukleóluszba kerülhet savasodáskor a nukleoláris elzáró szekvencia (NoDS) révén, mely a fehérjekódoló régióban lévő kis szekvenciamotívumokból áll. A C-terminális domén 2 állandósult ciszteingazdag fémkötő motívumot (CysA, CysB; 1012-től és 1083-tól) tartalmaz a PCNA-kötéshez, illetve a további alegységek aktiválásához. A CysB a citoszolikus vas-kén fehérjekomplex (CIA) által hozzáadott [4Fe-4S] csoportot koordinál, mely a mitokondriális vas-kén csoport (ISC) szerkezetét igényli. Az érést a magcélzó CIA1/CIA2B/FAM96B-MMS19 komplex mediálja, mely az apoproteinnel kölcsönhatva biztosít specifikus Fe-S-csoport-beillesztést.
bélyegkép|2. ábra: A humán p125 exonukleázdoménje állandósult motívumai. Az I–III. motívumok a B-családban állandósultak, a IV–V. pedig a δ és ε polimerázokban közösek. E domén 3 szekvenciamotívumot (ExoI–ExoIII) tartalmaz mintával. A DEDD aminosavak ligandumok a katalízishez szükséges fémionokhoz, és félkövérrel szerepelnek (D316 és E318 az ExoI-ben, D402 az ExoII-ben és D515 az ExoIII-ban). A Y511 révén a p125 DDeDy-típusú exonukleáz Zuo–Deutscher-nevezéktan alapján, és ez szükséges a katalízishez.|jobbra Kötés- és asszociációs tanulmányok szerint a POLD2 erősen asszociál a POLD1-gyel. A POLD3 és a POLD2 egymással kölcsönhat, a POLD4 kölcsönhat a POLD1-gyel és a POLD2-vel. Az Sf9-sejtekben génkoexpresszióval előállított Polδ-heterotetramer a borjú-csecsemőmirigyből kinyerthez hasonlít, a teljes holoenzimet erősen stimulálja a PCNA. Számos tanulmány kimutatta, hogy míg a POLD1 polimeráz- és 3’–5’-exonukláz-ellenőrzőaktivitással is rendelkezik, a többi alegység ezeket, a DNS-kötő képességet és a működéshez fontos kölcsönhatásokat a PCNA-val és az RFC-vel növeli. A Polδ-holoenzimbe gyakran beleértik a PCNA-t és az RFC-t a 4 polimerázrész mellett.
Számos további tanulmány további kölcsönható partnert azonosított a DNS-replikációhoz és -javításhoz kapcsolódó funkciókkal. A 3. ábra ismert és feltételezett kölcsönhatásokat tartalmaz replikáció és javítás során. A website at Vanderbilt University provides additional interaction on important POLD1 protein structure and various classes of gene and protein interaction, based on criteria such as co-occurrence in a complex, direct physical interaction, regulatory relationship, and co-expression.
Polimeráz δ-alegységHumánfehérje-név Homo sapiensMus musculusSaccharomyces cerevisiaeSchizosaccharomyces pombeA (catalytic)p125POLD1-Chr 19q13.3Pold1-Chr 7B4POL3-Chr IVcdc6-Chr IIB (accessory)p50POLD2-Chr 7p13Pold2-Chr 11A2POL31-Chr Xcdc1-Chr IC (accessory)p66POLD3-Chr 11q14Pold3-Chr 7F1POL32-Chr Xcdc27-Chr IID (accessory)p12POLD4-Chr 11q13Pold4-Chr 19A -cdm1-Chr II1. táblázat: A DNS-polimeráz δ alegységeinek nevei és helyei ember, egér, S. cerevisiae és S. pombe esetén
Expresszió és szabályzás bélyegkép|312px|3. ábra: Ismert és feltételezett POLD1-partnerek a STRING-ből (kivonás dátuma: 2016. március 31.).). Középen a POLD1 (zöld), piros vonalak jelölik kölcsönhatásait. A kék ellipszisek a magkomplex további részeit, a rózsaszínek további feltételezett kölcsönhatásokat jelölnek a DNS-javításban és -replikációban. Szürke vonalak jelölik a különböző fehérjék közti kölcsönhatásokat. A hálózat Cytoscape-pel készült. A kölcsönhatások a BIND, DIP, GRID, HPRD, IntAct, MINT és PID adatbázisokból kinyert, a STRING által ellenőrzött nagy bizonyosságú kísérleti adatokat mutatnak. A kísérleti pontszámok az affinitáson és a kromatográfián alapuló assay-eken alapulnak. A POLD1-et számos humán szövet expresszálja, különösen a szívéi és a tüdőéi. A sejten belül elsősorban a sejtmagban és a nukleoplazmában található.
A POLD1-mennyiség a szeneszcens humán bőrfibroblasztokban és az idős limfocitákban csökken. A POLD1-expresszió DNS-károsodáskor epigenetikailag szabályzott. Más tanulmányok kimutatták, hogy a POLD1-expressziót szabályozzák a miR-155, a p53 és a PVT1 hosszú nemkódoló RNS. DNS-károsodás vagy replikációs stressz (például ultraibolya fény, metil-metánszulfonát, hidroxikarbamid vagy afidikolin esetén a POLD4 gyorsan lebomlik. A p125 katalitikus aktivitása más a heterotetramerben (Polδ4, p12-vel) és a heterotrimerben (Polδ3, p12 nélkül). A heterotrimer termelése a p12 RNF8 E3-ligáz általi bontásától függ, mely a DSB-javításban és feltehetően a homológ rekombinációban (HR) fontos. Ezenkívül a CRL4Cdt2 le tudja bontani normál DNS-replikáció során és DNS-károsodás jelenlétében. A POLD4-et lebonthatja továbbá a μ-kalpain proteáz, mely a kalcium okozta apoptózisban fontos.
A POLD1 rendelkezik az acidózisra adott választ, a nukleóluszba való szállítást szabályzó NoDS-doménnel. Ez közvetlen kölcsönhatást igényel a p50-alegység és a WRN közt. A DNS-károsodásra adott válasz során a WRN a nukleóluszból kimenve szabadítja fel a Polδ-t. A POLD1 ezenkívül PDIP46/SKAR-ral és az LMO2-vel is kölcsönhat. Funkció DNS-replikáció A DNS-replikáció sok enzimet és fehérjét, például több DNS-polimerázt igénylő erősen szervezett folyamat. A fő replikatív aktivitás az S-fázisban 3 polimerázon – a DNS-polimeráz α-n (Polα), δ-n (Polδ) és ε-on (Polε) alapul. Miután a DNS-polimeráz α elindítja a DNS-szintézist, a Polδ a követő, a Polε a vezető szálon folytatja a szintézist. Ezek nagyon magas hűséget biztosítanak a Watson–Crick-bázispárosodás és a 3’-exonukleáz- (ellenőrző) aktivitás révén. Egy 2015-ös tanulmány szerint a Polδ állíthatja elő a vezető szálat is. E polimerázok működése a többi replikációs faktorral összefüggésben fontos, mivel a hibáik esetén létrejövő mutációkat is megmagyarázza. A replikációs hűség fenntartása érzékeny egyensúly a DNS-polimeráz δ és ε hibái közt, az ellenőrzés és az MMR közt, valamint a két szál ribonukleotid-feldolgozásának megkülönböztetése. Élesztőben végzett kísérletek szerint a Polδ és a Polε homológjainak exonukleáz-mutációi mutátorfenotípust okozhatnak. A követőszál-szintéziskor létrejöt ssDNS-t az ssDNS-károsító anyagok célozhatják, továbbá az APOBEC-mutációk szelektív célpontja. DNA-binding proteins that rapidly reassociate post-replication prevent Polδ from repairing errors produced by Polα in the mature lagging strand. Yeast studies have shown that Polδ can proofread Polε errors on the leading strand. DNS-javítás