Az i-motívumú DNS (a beágyazott motívumú DNS rövidítése) a G-kvadruplexekhez hasonló citozingazdag 4 szálú DNS-szerkezet. Gátolja a telomerázt, így rákterápiában való használatát sokszor kutatták. Történet A szerkezetet először 1993-ban fedezte fel Maurice Guéron a palaiseau-i École Polytechnique-ben. Két protonált citozinbázispárt (C·) tartalmazó antipárhuzamos kétszálú DNS-komplex 4 szálú DNS-sé valóasszociációjakor fedezte fel. Eredetileg csak in vitro fedezték fel, általában kicsit savas pH mellett, de 2018-ban humán sejtek magjában is észlelték. Új antitestet is létrehoztak, mely erősen i-motívum-specifikus, más DNS-ekhez nem köt, így optimális az i-motívumok azonosítására a sejtekben.
2018. áprilisi közleményükben dr. Mahdi Zeraati et al. kimutatták, hogy e komplexek folyamatosan jönnek létre és szűnnek meg folyamatosan változó hőmérsékletük miatt, mely a génexpresszió és a sejtnövekedés szabályzásában fontos lehet. Bár pontos funkciójuk ismeretlen, átmeneti természetük alapján megismerhető biológiai szerepük. Elsősorban a sejtciklus G1 fázisában és promoterekben vannak jelen, és befolyásolhatják, mely gének olvashatók, így fontos lehet a gének be- és kikapcsolásának szabályzásában. További kísérletek folynak az i-motívumok nanotechnológiai szerepe iránt azok bioszenzorként és nanogépként való használata terén, és a rákterápia előrehaladásában is fontosak lehetnek. Szerkezeti áttekintés bélyegkép|RNS-i-motívum-szerkezet a kvadruplex citozinjaival. bélyegkép|C· bázispár i-motívumban. A párosodási energia 169,7 kJ/mol. A közbeékelt guaninokkal rendelkező G-kvadruplexekhez hasonlóan az i-motívumok többségükben citozint tartalmazó antipárhuzamos oligodezoxinukleotidokból állnak. Itt a kölcsönhatások a citozinok hemiprotonálásával és Hoogsteen-bázispárosodással történik. Két fő közbeékelt topológiába sorolhatók az i-motívumok, ezek a 3’-E, ahol a külső C: a 3’-végen van, és az 5’-E, ahol az 5’-végen. A 3’-E stabilabb a nagyobb cukor-cukor érintkezésektől. Ennek oka a két topológia van der Waals-energiáiban. A cukor-cukor érintkezések kölcsönhatásai a kis bemélyedések mentén optimális vázcsavarodást tesz lehetővé, mely a bázishalmozódás létrejöttét és a molekula stabilitását okozza. Azonban az i-motívumok stabilitása az egymással kölcsönható citozinok számától függ: minél több a hidrogénkötéssel egymással kölcsönható citozin, annál stabilabb a molekula. A stabilitást ezenkívül befolyásolják a hőmérséklet, a sókoncentráció és a pH.
Bár sok i-motívum enyhén savas (4,2–5,2) pH mellett a legstabilabb, egyes i-motívumok semleges pH-ban alakulnak ki, ahol a szabad protont a szerkezetkialakítás során használja fel a nukleinsav. Ezek bizonyos körülmények, például alacsony hőmérséklet (277 K), molekulatömörülés, negatív szuperhelicitás és jelenléte esetén alakulhatnak ki. A negatív szuperhelicitás fontos az i-motívumok semleges pH melletti stabilizálásához.
Az i-motívumok biológiai környezetekben is kialakulhatnak. E szerkezetek számos sejtbeli helyben, például sejtmagban, citoplazmában, telomerekben és promoterekben is ismertek. Megtalálhatók sejtfolyamatokban is, például a G1 sejtciklusfázisban. Stabilitás Nukleinsav-szerkezetként az i-motívum stabilitása függ a szekvencia természetétől, a hőmérséklettől és az ionerősségtől. Szerkezeti stabilitása elsősorban a hattagú aromás pirimidinek közti csekély átfedésen alapul az egymást követő bázispárok közbeékelődő geometriája miatt. Az antipárhuzamosan elrendezett cikluson kívüli karbonil- és aminocsoportok fontosak a C: bázispárok stabilitásához a töltött aminocsoportok közti elektrosztatikus taszítás kompenzációjának hiánya miatt. Egyéb tényezők, például a C-sorozat hossza, a cukor-foszfát, sapka-kötőkör és ionos kölcsönhatások, a molekuláris tömörülés és a szuperhelicitás is befolyásolják az i-motívum-stabilitást. C: bázispárok A C: bázispárok adják az i-motívum-stabilitás nagyját a 3 hidrogénkötés miatt. Ezt jelzi, hogy az i-motívum bázispárosodási energiája (BPE) 169,7 kJ/mol, viszonylag nagy a C·C és a Watson–Crick-féle G·C-hez képest (68, illetve 96,6 kJ/mol). A legstabilabb központi hidrogénkötést a C:-ban (N3··H··N3) kétkutas potenciálúként írják le a proton két nitrogén közti oszcillációja miatt, a protontranszfer-sebesség .
Waller csoportja és Mir et al. tanulmányai az elektrosztatikus kölcsönhatások fontosságát emelte ki a C: bázispár stabilitásában. Waller et al. a 2-dezoxiriboguanilkarbamid (GuaUre-dR) kemoterápiás szer hatását vizsgálták a humán telomerekben. Azt találták, hogy a GuaUre-dR hozzáadása csökkenti a pH-t az azt nem tartalmazó i-motívumokhoz képest. Mir et al. kimutatták, hogy a pszeudoizo-dezoxicitidin (psC) hozzáadása a fej-fej és fej-farok i-motívum-dimerek stabilitását növelte a C:C-sorozat végén lévő semleges psC:C esetén. Mindkét tanulmány kimutatta, hogy a szerkezetek magjában lévő pozitív töltések járultak leginkább a C: bázispár stabilitásához.
A C: környezeti feltételeinek megváltozásakor Watkins et al. stabilitásváltozást figyeltek meg. A C: bázispár az 5. helyen halogénezett (fluorozott, brómozott, jódozott) származékaival a citozin helyén növelték az i-motívum-stabilitást savas pH mellett. Ezzel elindult a vizsgálat citozinmetiláció és ennek pH-ra gyakorolt hatása terén is. Az 5. helyen való citozinmetiláció növelte az átmenet közepi pH-t és az i-motívumok -ét. A hidroximetiláció mindkét téren csökkenést okoz. Foszfátváz-cukor kölcsönhatások Az i-motívum kis bemélyedése két egymást taszító negatív töltésű oldalból álló foszfátvázat tartalmaz, melyek közt egyensúly kell a szerkezet stabilizálásához. A hidrogénkötések és a van der Waals-erők a kis bemélyedés cukrai közt a tetramer i-motívum d(CCCC) szakaszában stabilizálják annak kis bemélyedését. A 3’-E és 5’-E topológiák stabilitását molekuladinamikai szimulációkkal figyelték meg a foszfátvázak közti taszítás meghatározásához. A megfigyelt stabilitás az alátámasztó kölcsönhatásokból származik, így az a cukorkölcsönhatások és az összekötő kör egyensúlyától függ. Ennek oka a hidrogénkötés alacsony szabadenergiája (2,6 kJ/mol) az i-motívumban.
Modifications to the phosphate backbone have been seen in research in which an alternative to the phosphate backbone was studied. Oligodeoxycytidine phosphorothioates can form intramolecular and intermolecular i-motifs. Mergny and Lacroix determined that the addition of a bulky methyl group had a destabilizing effect on the i-motif formation when they compared phosphorothioate, the natural phosphodiester, methylphosphonate, and peptide linkages and determined that only phosphodiester and phosphorothioate oligodeoxynucleotides were capable of forming stable i-motifs. Környezeti körülmények Az i-motívumok keletkezésének vizsgálata fiziológiás pH mellett a molekuláris tömörülés, a szuperhelicitás-kialakulás és a kationos körülmények szimulációját igényli. Nagy molekulatömegű polietilén-glikolok használatával kongesztált molekuláris és magi környezeteket indukáltak. A citozin N3-pKa-növekedése alapján e körülmények a kvadruplexeket és i-motívumokat preferálták a két- és egyszálú DNS felett az i-motívum-képzés és protonáció indukciója során semleges pH-n. A negatív szuperhelicitás segíti az i-motívum-képzést fiziológiás körülmények közt. A G-kvadruplex- és i-motívum-képzés semleges pH-n történhet, ha az ezeket alkotó MYC-onkogén-promoter-szakaszok szupertekercselt plazmidban vannak, mindkét szerkezet szuperhelicitását indukálva. Ezek megszüntetésének feltételei azon alapulnak, hogy az i-motívum destabilizálja a kétszálú szerkezeteket. Ez a transzkripciós folyamatot is tükrözi, melyben a szupertekercselt DNS egyszálúvá bomlik, negatív szuperhelicitást okozva. Az i-motívum-stabilitást az ionkoncentráció befolyásolhatja. A Na-hozzáadás növeli az i-motívum destabilizációját a JUN protoonkogénről 4,8-es pH esetén. Az i-motívum-stabilitás csökkenése megfelel az ionkoncentráció növekedésének egy n-Mycből származó i-motívum tanulmányában. Azonban nem találtak jelentős stabilitáskülönbséget 5 mM vagy hozzáadásakor 100 mM NaCl jelenlétében 6,4-es pH esetén. Bázismódosítások További vizsgálatok szükségesek a bázismódosítások i-motívum-stabilitásra gyakorolt abszolút hatásáról, de beszámoltak tanulmányok a stabilitást befolyásoló bázismódosításokról. Két példa erre a citozin 5-metilcitozinra és a timin 5-propiniluracilra való cseréje, ezek növelik a stabilitását. A bázismódosítások fontosak lehetnek pH-/hőmérséklet-dependens i-motívum-szerkezetiminták tekintetében. Keletkezés Az i-motívumok a sejtmagokban félprotonált C–semleges C bázispárok kapcsolódásával alakulnak ki enyhén savas pH-val. In vitro ezek telomerekből származó DNS-ekre utaló jelekkel rendelkezhetnek. Számos biofizikai technika használatával kimutatták, hogy az i-motívum centromerekből és protoonkogén-promoterekből származnak. Ezek elemzése alapján a szerkezetek általános stabilitása a citozinok mennyiségétől és a körök hosszától és összetételétől függ az intra- és intermolekuláris szerkezetekben is.
Bár ismert, hogy a C-gazdag szakaszok i-motívumokat alkothatnak in vitro, még vitatott, hogy in vivo léteznek-e négyszálú i-motívum-szerkezetek a humán genomban. Igazolták, hogy az i-motívumok fiziológiai pH esetén létrejöhetnek bizonyos molekulatömörülési feltételek és transzkripció során indukált negatív szuperhelicitás esetén. Egy 2014-es tanulmány kimutatta, hogy az i-motívumok bizonyos genomszakaszok általi létrejötte semleges pH esetén is létrejöhet, és befolyásolják a DNS-feldolgozásban a keletkezésük után a replikációt és transzkripciót. G-kvadruplex-keletkezés Az i-motívumok a G-kvadruplex-képző szakaszok bármely komplementer szakaszából létrejöhetnek. A G-kvadruplexek helikálisak és G-gazdag nukleinsavakban találhatók. E másodlagos szerkezetek G-tetrádokból állnak, melyek állhatnak 1, 2 vagy 4 szálból. A G-kvadruplex-képző szakaszok i-motívum-képzési hajlamának ismeretében Waller et al. a Quadparser algoritmust használták a humán genom i-motívum-képző szakaszai számának meghatározására. Ez 4 ötcitozinos C-szakaszból állt változó számú (1–19) nukleotiddal. A humán genom egészében 5125 szakasz lehet képes i-motívum-képzésre, ezek 12,4%-a (637) található promoterek szakaszaiban. A promotereknek megfelelő ontológiai kódok alapján az i-motívum-képzés elsősorban a DNS-kötéshez, a DNS-templátú transzkripcióhoz, a vázrendszerfejlődéshez és az RNS-polimeráz II pozitív transzkripciószabályzásához kötődik. Kölcsönható ágensek és ligandumok G4-ligandumokból származó kölcsönható ágensek Tetra-(N-metil-4-piridil)porfirin (TMPyP4) Az i-motívum-kötő ligandumot meghatározó első tanulmányt Hurley et al. végezték 2000-ben. A tetra-(N-metil-4-piridil)porfirin (TMPyP4) és a humán telomerszakaszból származó tetramolekuláris i-motívum kölcsönhatását vizsgálták a DNS-olvadáspontot jelentősen nem változtató elektroforetikus mobilitáseltoló assay-vel (EMSA). A ligandum a G4-gyel az i-motívumon kölcsönhat, deregulálva a MYC-expressziót és gátolva a telomerázt. Két TMPyP4 koordinál az i-motívummal annak tetején és alján NMR-kísérletek alapján. Fenantrolin- és akridinszármazékok E magokra a fenantrolinszármazékok jellemzők G4-kötő és telomerázgátló képességük miatt. Ez növeli az i-motívum olvadáspontját. A fenantrolinszármazékok a C:C bázispárhoz kötnek, a normál G-kvadruplexé alá csökkentve a kötési állandót. A G4-ligandumok közt vannak akridinszármazékok is, és fluoreszcenciarezonanciaenergiatranszfer-assay-k (FRET) révén a dietiléntriamint (BisA) az i-motívumok és a G4-ek esetén is olvadáspont-növelőként írták le, míg az akridinmonomernek (MonoA) nincs ily hatása. Makrociklikus tetrakonazolok, L2H2-4OTD