Megosztásos-keveréses szintézis

A megosztásos-keveréses szintézis (M&K szintézis) a kombinatorikus kémia egyik módszere, amely kombinatorikus vegyülettárak előállítására használható. Ez egy lépcsőzetes, rendkívül hatékony kémiai szintetikus folyamat, amely ismételt ciklusokban valósul meg. Az eljárás lehetővé teszi több millió vagy akár milliárd vegyület előállítását keverékként, amelyet a gyógyszerkutatásban hasznosíthatnak.

Története

A hagyományos módszerek szerint a legtöbb szerves vegyületet egyenként szintetizálják építőelemekből, amelyek egymás után, lépcsőzetesen összekapcsolják őket. 1982 előtt nem volt lehetőség egyetlen eljárással több száz vagy több ezer vegyület előállítására sem. Tehát a Furka Árpád professzor (Eötvös Loránd Tudományegyetem Szerves Kémiai Tanszék) által feltalált megosztásos-keveréses módszer produktivitása 1982-ben, első látásra hihetetlennek tűnt. A módszert még ugyanabban az évben közjegyzői okiratban leírták és hitelesítették. A dokumentum magyar nyelvű. de angolra is lefordították.Furka Á. Tanulmány, gyógyászatilag hasznosítható peptidek szisztematikus felkutatásának lehetőségéről (and Study on the possibility of systematic searching for pharmaceutically useful peptideshttps://mersz.hu/mod/object.php?objazonosito=matud202006_f42772_i2 . A találmányhoz vezető motivációkat egy 2002-es cikkÁ. Furka, Combinatorial chemistry: 20 years on …Drug Discovery Today 2002, 7, 1-2. A találmányhoz vezető motivációkat egy 2002-es cikk tartalmazza. A módszert először 1988-ban tették közzé nemzetközi kongresszusokon,Á. Furka, F. Sebestyén, M. Asgedom, G. Dibó, Cornucopia of peptides by synthesis In Highlights of Modern Biochemistry, Proceedings of the 14th International Congress of Biochemistry, VSP. Utrecht, The Netherlands, 1988, Vol. 5, p 47. majd 1991-ben nyomtatásban.Furka Á, Sebestyén F, Asgedom M, Dibó G ( 1991) General method for rapid synthesis of multicomponent peptide mixtures, Int J Peptide Protein Res 37; 487-93.

A megosztásos-keveréses szintézis és jellemzői

A megosztásos-keveréses szintézis eltér a hagyományos szintetikus módszerektől. Fontos újdonság a vegyületkeverékek alkalmazása az eljárásban. Ez az oka a példátlanul magas termelékenységének. A módszert használva egyetlen vegyész több vegyületet tud előállítani egy hét alatt, mint amennyit az K&M szintézis bevezetése előtt, a kémia teljes története során előállított a valaha élt összes vegyész. A K&M szintézist lépésenként alkalmazzák, három művelet megismétlésével a folyamat minden lépésében: Egy összetett keverék egyenlő részekre osztása Egy-egy különböző blokkok csatlakoztatása minden részhez Az adagokat egyesítse és alapos összekeverése

Az eredeti módszer Merrifield szilárd fázisú szintézisén alapul.Merrifield R.B. Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide (1963) J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154.

Az eljárást az ábrán a folyamatábra szemlélteti, amely egy kétciklusú szintézist mutat be, mindkét ciklusban ugyanazt a három építő-vegyületet (blokkot) használva. A K&M szintézisben a szilárd fázisú módszer megválasztása észszerű, mert ellenkező esetben a melléktermékek eltávolítása a vegyületkeverékből nagyon nehéz lenne.

Hatékonyság balra|bélyegkép|300px|Kombinatorikus peptidtár szintézise hagyományos módszerrel. A kapcsolások során képződő minden peptid szétosztandó és reagáltatandó a következő kapcsolási lépés valamely aminosavával

A módszer legfontosabb jellemzője a nagy hatékonyság. Egy n lépésből álló szintézisben azonos számú építőelemet használva (k) minden lépésben, a vegyületek száma a képződő kombinatorikus tárban (N):

Ez azt jelenti, hogy a komponensek száma a lépések (ciklusok) számával exponenciálisan növekszik, míg a szükséges kapcsolások száma csak lineárisan emelkedik. Ha eltérő számú építőelemet használunk a ciklusokban (k1, k2, k3....kn), akkor a képződő komponensek száma:

Az eljárásnak ez a tulajdonsága gyakorlatilag korlátlan számú vegyület szintézisére ad lehetőséget. Például, ha 1000 építőelemet használnak fel négy ciklusban, akkor várhatóan 1 billió vegyület képződik. A szükséges kapcsolások száma mindössze 4000!

A nagy hatásfok oka Racionalizált hagyományos szintézis. Minden egyes képződött vegyületet felosztanak, majd a következő lépés egyik reagensével reagáltatják

A rendkívüli hatékonyság magyarázata a keverékek alkalmazása a szintézis lépéseiben. Ha egy hagyományos reakcióban egy vegyületet egy reagenssel kapcsolunk össze, egy új vegyület keletkezik. Ha n komponenst tartalmazó vegyületkeveréket egyetlen reagenssel kapcsolunk, akkor az egyetlen kapcsolásban képződő új vegyületek száma n. A hagyományos és a M&K szintézis közötti különbséget meggyőzően mutatja a kapcsolási lépések száma a hagyományos és a 3,2 millió pentapeptid M&K szintézisében.

Hagyományos szintézis: 3 200 000 x 5 = 16 000 000 kapcsolási lépése kb 40 000 évig tartana, míg az M&K szintézis: 20 x 5 = 100 kapcsolási lépése megvalósítható kb. 5 nap alatt.

Lehetőség van a hagyományos szintézis racionális módon történő végrehajtására, ahogy az az ábrán látható. Ebben az esetben a csatolási ciklusok száma:

20+400+8000+160000+3200000=3368420 kb. 9200 év

Az alkotóelemek számának elméleti felső határa Amint azt gyakran említetik, az M&K módszer korlátlan számú vegyület szintetizálását teszi lehetővé. Valójában a komponensek elméleti maximális száma a vegyülettár mólokban kifejezett mennyiségétől függ. Ha például 1 mol tárat szintetizálunk, a komponensek maximális száma megegyezik az Avogadro-számmal: 6,02214076·1023

Egy ilyen vegyülettárban minden komponenst egyetlen molekula képvisel.

A vegyülettár komponensei egyenlő moláris mennyiségben képződnek Az M&K szintézisben a vegyülettárak komponensei közel azonos moláris mennyiségben képződjenek amennyiben a kapcsolások kémiája ezt lehetővé. Ezt a keverékek egyenlő mintákra osztása és az egyesített minta homogenizálása teszi lehetővé. A tár komponenseinek azonos moláris mennyisége nagyon fontos az alkalmazhatóságot tekintve. A vegyületek nem egyenlő mennyiségben való jelenléte nehézségeket okozhat a biológiai hatásvizsgálatok eredményeinek értékelésében. A szilárdfázisú módszer lehetővé teszi a reagensek feleslegben történő felhasználását – és ez által a teljes átalakulás közelítését - mivel a felesleg könnyen eltávolítható szűréssel.

Két keverék felhasználásának lehetősége a szintézisben Elvileg két keverék alkalmazása a szintézis minden lépésében, ugyanazt a kombinatorikus tárat eredményezheti, mint az M&K módszer. Az építőblokkok reakciókészségében mutatkozó különbségek azonban nagy különbségeket okoznak a képződő komponensek mólarányában, és a különbségek minden lépés után várhatóan növekedni fognak. Bár jelentős mennyiségű munka lenne megtakarítható meg a kétkeverékes megközelítés alkalmazásával, amikor nagyszámú építőblokkot kapcsolunk mindegyik pozícióban, tanácsos ragaszkodni a szokásosan használt M&K eljáráshoz.

Az összes szerkezeti változat jelenléte a kombinatorikus tárban Az M&K szintézis során képződő kombinatorikus vegyülettárak egyik jellemzője az, hogy az építőblokkok szerkezetéből levezethető összes szerkezeti változatot tartalmazza. Ezt csak az M&K módszerrel lehet egyetlen folyamatban elérni. Másrészt, ha az összes lehetséges szerkezeti változat jelen van a vegyülettárban, az azt mutatja, hogy a tár kombinatorikus, és az, M&K szintézissel készült.

Egy vegyület képződése a hordozó szemcséiben balra|bélyegkép|Egyetlen vegyület képződik minden szemcsén Egyetlen vegyület képződése minden szemcsén Ha egyetlen építőblokkot használunk a vegyületkeverékekkel történő kapcsolásokban, akkor minden szemcsében csupán egyetlen vegyület képződik. Az un. Egy Szemcse-Egy-Vegyület (angolul OBOC) vegyülettárak kialakulása az M&K szintézis velejárója. Az ok az ábrán látható. Bármely kiválasztott szemcsében képződött vegyület szerkezete attól függ, hogy a szemcse véletlenszerűen mely reakcióedényekbe kerül a szintézis során. Az a kémikus döntésétől függ, hogy a tárat kötött (OBOC) vagy lehasított formában használja-e.

A megosztásos-keveréses szintézis megvalósítása bélyegkép|600px|Manuális S&K szintetizátor Az M&K szintézist először szilárd hordozón lévő peptidtárak előállítására alkalmazták. A szintézisre használt készülék egy laboratóriumi rázógépre szerelt 20 lyukkal ellátott alumínium cső, amelyet vízsugárszivattyúval van összekötve. A cső lyukaiban 20 reakcióedényt lehet gumigyűrű csatlakozással rögzíteni. A cső egyik vége zárt, másik vége pedig egy hulladéktartályhoz és azon keresztül vízsugár szivattyúhoz van csatlakoztatva. A baloldalon a töltés és a szűrés, a jobb oldalon a kapcsolási-rázási helyzet látható. A kombinatorikus kémia korai éveiben az AdvancedChemTech (Louisville KY, USA) egy automata gépet építettek és forgalmaznak ma is. Az M&K szintézis összes művelete automatikusan, számítógépes vezérléssel történik. Jelenleg a Titan 357 automatikus szintetizátor elérhető az aapptec-nél (Louisville KY, USA).

Kódolt megosztásos-keveréses szintézis Bár az M&K szintézis során minden szemcsén egyetlen vegyület képződik, annak szerkezete nem ismert. Emiatt kódolási módszereket vezettek be, amelyek segítenek meghatározni a kiválasztott szemcsében lévő vegyület azonosságát. A kódoló molekulákat az építő blokkokkal párhuzamosan kapcsolják a hordozóhoz. A kódoló molekulákra jellemző, hogy szerkezetüket könnyebb meghatározni, mint a szemcséken lévő vegyület szerkezetét. Ohlmeyer és munkatársai közzétettek egy bináris kódolási módszert.Ohlmeyer MHJ, Swanson RN, Dillard LW, Reader JC, Asouline G, Kobayashi R, Wigler M, Still WC (1993) Complex synthetic chemical libraries indexed with molecular tags, Proc Natl Acad Sci USA 90; 10922–10926. 18 jelölőmolekulából álló keverékeket használtak, amelyeket a szemcsékről történő lehasításuk után gázkromatográfia segítségével azonosítottak. Nikolajev és munkatársai peptidszekvenciákatV. Nikolaiev, A. Stierandova, V. Krchnak, B. Seligman, K. S. Lam, S. E. Salmon, M. Lebl Pept. Res. 1993, 6, 161. Sarkar és munkatársai penténsavamidok oligomerjeit használta kombinatorikus tárak kódolásáraSarkar M, Pascal BD, Steckler C, Aquino C., Micalizio GC, Kodadek T, Chalmers MJ (1993) Decoding Split and Pool Combinatorial Libraries with Electron Transfer Dissociation Tandem Mass Spectrometry, J Am Soc Mass Spectrom 24(7): 1026-36. Kerr és munkatársai bevezették a kódolás innovatív fajtáját.J. M. Kerr, S. C. Banville, R. N. Zuckermann J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 2529. A szemcsékhez egy ortogonálisan védett, eltávolítható bifunkciós linkert erősítettek. A linker egyik végét a vegyülettár építőblokkjainak kapcsolására használták, míg a másik végéhez pedig a kódoló aminosavhármasokat kapcsoltak. Az egyik legkorábbi és nagyon sikeres kódolási módszert Brenner és LernerS. Brenner and R. A. Lerner Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89, 5381. vezette be 1992-ben. Azt javasolták, hogy DNS-oligomereket kapcsoljanak a szemcsékhez, amelyekben a nukleotidok sorrendje kódolja a szerkezetet. A módszert Nielsen, Brenner és JandaJ. Nielsen, S. Brenner, K. D. Janda J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 9812. valósította meg, amelyben Kerr és munkatársai bifunkcionális linkerét használták kódoló DNS-oligomerek rögzítésére.

Megosztásos-keveréses szintézis oldatban Han és munkatársai olyan módszert írtak le, amely lehetővé tette az M&K szintézis nagy hatékonyságának és a homogén közeg előnyeinek megtartását a kémiai reakciókban.H. Han, M. M. Wolfe, S. Brenner, K. D. Janda Liquid-phase combinatorial synthesis Proc Natl Acad Sci USA 1995, 92:6419.https://doi.org/10.1073/pnas.92.14.6419. Módszerükben a polietilénglikolt (PEG) használták oldható hordozóként a peptidtárak szintézisében.

A PEG alkalmasnak bizonyult erre a célra, mivel sokféle vizes és szerves oldószerben oldódik, és oldhatósága homogén reakciókörülményeket biztosít még akkor is, ha