A DNS-szekvenálás a dezoxiribonukleinsav nukleinsav-szekvenciája meghatározása. Mindazon módszereket és technológiákat magában foglalja, melyek a 4 bázis – adenin, timin, citozin, guanin – sorrendjét határozzák meg. A gyors DNS-szekvenálási módszerek a biológiai és orvosi kutatásokat és felfedezéseket jelentősen felgyorsították.
A DNS-szekvenciák ismerete elengedhetetlen lett a biológiai alapkutatásban, a DNS-genográfiai projektekben, és számos alkalmazott területben, például az orvosi diagnosztika, biotechnológia, igazságügyi biológia, virológia és biológiai rendszertan területén, az egészséges és mutáns DNS-szekvenciák megkülönböztetése sok betegséget, például több ráktípust is felismerhet, leírhatja az antitest-diverzitást, és használható kezelés személyreszabására. A gyors DNS-szekvenálási módszer lehetővé teszi a gyorsabb és személyre szabottabb orvosi kezelést és több élőlény azonosítását és katalogizálását.
A DNS-szekvenálás gyors fejlődése fontos szerepet játszott számos faj, például az ember szekvenálásában, de számos más állat-, növény- és mikrobafaj szekvenálását is lehetővé tette. bélyegkép|Automatikus lánclezárásos DNS-szekvenálás eredménye
Az első DNS-szekvenciákat az 1970-es évek elején hozták létre kutatók kétdimenziós kromatográfián alapuló bonyolult módszerrel. A DNS-szekvenálóval történő fluoreszcenciaalapú eljárások a szekvenálást megkönnyítették és sokkal gyorsabbá tették. Alkalmazás A DNS-szekvenálás felhasználható bármely élőlény egyes génjei, nagyobb genetikai szakaszai (például géncsoportok, operonok), teljes kromoszómái vagy akár teljes genomjai szekvenciájának kiderítésére. A DNS-szekvenálás továbbá a leghatékonyabb mód RNS vagy fehérjék közvetett szekvenálására nyitott leolvasási kereteken keresztül. A DNS-szekvenálás alapvető technológia lett a biológia számos területén, de máshol is, például az orvostudomány, az igazságügy és az antropológia területén is. Molekuláris biológia A szekvenálást a molekuláris biológia a genomok és az általuk kódolt fehérjék tanulmányozására használja. Az így szerzett információ a gének és a nem kódoló DNS (beleértve a szabályzó szekvenciákat) változásait, betegségekkel és fenotípusokkal való kapcsolataikat és lehetséges gyógyszercélpontokat azonosít. Evolúcióbiológia Mivel a DNS az egyik generációról a másikra való információátadás fontos molekulája, a DNS-szekvenálást az evolúcióbiológia is használja a különböző élőlények kapcsolatai és fejlődése kutatásában. 2021 februárjában elsőzör számoltak be kutatók 1 millió évnél régebbi állati – egészen pontosan mamutból származó – karrionokból származó DNS szekvenálásáról, ami ezzel a legrégebbi szekvenált DNS lett. Metagenomika
A metagenomika adott élőhelyen – például víztestben, szennyvízben, talajban, bomlástermékben vagy kenetmintában – jelenlévő élőlényeket azonosító tudomány. A környezetben élő fajok ismerete elengedhetetlen az ökológiában, epidemiológiában, mikrobiológiában stb. A szekvenálás lehetővé teszi például az adott mikrobiomban jelenlévő élőlények meghatározását. Virológia
Mivel a legtöbb vírus túl kicsi, hogy fénymikroszkóppal látható legyen, azonosításuk és tanulmányozásuk egyik legfőbb eszköze a szekvenálás. A vírusgenomok lehetnek DNS- vagy RNS-alapúak. Az RNS-vírusok időérzékenyebbek, mivel klinikai mintákban gyorsabban bomlanak. A hagyományos Sanger-szekvenálás és az új generációs szekvenálás használatosak a vírusok alap- és klinikai kutatásban való szekvenálásához és a kialakuló vírusfertőzések diagnózisához, a patogén vírusok molekuláris epidemiológiai vizsgálatához és a gyógyszerrezisztencia-ellenőrzéshez. A GenBankben több mint 2,3 millió vírusszekvencia található. 2019-re az NGS gyakoribb vírusgenom-szekvenálási eljárás lett a Sanger-szekvenálásnál.
Az 1997-es madárinfluenza-járvány során vírusszekvenálással derült ki, hogy az influenzaaltípus a fürjek és a baromfik közti reassortmenttel alakult ki. Ezért a hongkongi törvényhozás megtiltotta az élő fürj és baromfi együttes eladását. A vírusszekvenálás használható egy vírusjárvány kezdetének molekuláris órán alapuló becslésére is. Orvostudomány Az orvostechnikusok szekvenálhatnak géneket (vagy akár teljes genomokat) annak meghatározására, hogy fennáll-e genetikai betegség kockázata. Ez a genetikai tesztelés egy formája, de egyes genetikai teszteknek nem része a DNS-szekvenálás.
2013-ban a DNS-szekvenálást egyre inkább használták ritka betegségek diagnózisára és tesztelésére. Ahogy egyre több ritka genetikai betegséget okozó gént azonosítottak, a molekuláris diagnózis egyre gyakoribbá vált. A DNS-szekvenálás a klinikusoknak lehetővé teszi a genetikai betegségek azonosítását, a kezelés javítását, a reprodukciós tanácsadást és a hatékonyabb terápiát. A génszekvenáló panelek a feltételezett rendellenesség lehetséges genetikai okai azonosítására használhatók.
Továbbá a DNS-szekvenálás használható meghatározott baktériumok azonosítására a pontosabb antibiotikum-kezeléshez, csökkentve az antibiotikum-rezisztencia kocskázatát azok populációiban.Mykrobe predictor –Antibiotic resistance prediction for S. aureus and M. tuberculosis from whole genome sequence data Igazságügy
A DNS-szekvenálás használható a DNS-profil-készítési módszerekkel együtt az igazságügyi azonosításra és szülőségi tesztre. A DNS-tesztelés az utóbbi évtizedekben sokat fejlődött, és már képes a DNS-lenyomatot a vizsgált élőlénnyel összekapcsolni. Az ujjlenyomatok, nyál, hajtüszők stb. DNS-mintái egyedileg azonosítják az élőlényeket. A DNS-teszt meghatározott genomok észlelésére alkalmas eszköz, mely egyedi és saját mintát ad. A 4 kanonikus bázis
A kanonikus DNS-szerkezet 4 bázisból (timin (T), adenin (A), citozin (C), guanin (G)) állnak. A DNS-szekvenálás e bázisok fizikai sorrendjének meghatározása egy DNS-molekulában. Számos más bázis is előfordulhat egy molekulában: például egyes bakteriofágokban a citozin helyén hidroximetilcitozin vagy hidroximetilglükóz-citozin állhat. Emlős-DNS-ekben is előfordulhatnak metilált vagy foszfoszulfatált bázisszármazékok. Szekvenálási technikától függhet egyes módosulások, például az emberben gyakori m5C C (5-metilcitozin észlelése.
A legtöbb élőlény DNS-ét in vivo csak kanonikus bázisaiból állítja elő, a replikáció utáni módosulással létrehozva a többit, például az m5C-t. Azonban egyes bakteriofágok közvetlenül tehetnek be nem standard bázist.
A módosítások mellett a DNS-t folyamatosan támadják környezeti ágensek, például UV-sugárzás és reaktív oxigénszármazékok. Jelenleg e sérült bázisokat a legtöbb DNS-szekvenáló módszer nem észleli, de a PacBio közzétett egy oly módszert, mely igen. Történet A DNS szerkezete és funkciója felfedezése A dezoxiribonukleinsavat (DNS) először Friedrich Miescher fedezte fel és izolálta 1869-en, de sok évtizedig kevéssé tanulmányozták, mert a fehérjéket gondolták az örökítőanyagnak, nem a DNS-t. Ez 1944 után megváltozott Oswald Avery, Colin Munro Macleod és Maclyn McCarty kísérletei után, ahol kimutatták, hogy a DNS-változtatás egy baktériumtörzset átváltoztathat másikká. Ez volt az első kimutatása annak, hogy a DNS képes a sejtek tulajdonságai változtatására.
1953-ban James D. Watson és Francis Crick írták le a DNS kettős hélix modelljét röntgen-krisztallográfia révén vizsgált szerkezetekkel, melyeket Rosalind Franklin tanulmányozott. A modell szerint a DNS-t 2 nukleotidokból álló szál alkotja, melyek egymás körül tekerednek, hidrogénkötések kapcsolják össze, és ellentétes irányban haladnak. Minden szál 4 komplementer nukleotidból áll, ahol az adenozin-monofoszfáttal szemben mindig timidin-monofoszfát, a citidin-monofoszfáttal szemben mindig guanozin-monofoszfát áll, és viszont. Leírták, hogy e szerkezet lehetővé teszi bármely szál rekonstrukcióját a másik alapján, ami alapvető jelentőségű az információ nemzedékek közti öröklése szempontjából. bélyegkép|Frederick Sanger, a szekvenálás úttörője. Sanger a kevés 2 Nobel-díjat szerzett tudós egyike: egyet a fehérjeszekvenálásért kapott, egyet a DNS-szekvenálásért.
A fehérjeszekvenálás alapjait Frederick Sanger fektette le, aki 1955-ben szekvenálta a hasnyálmirigy által termelt egyik kis fehérje, az inzulin aminosavjait. Ez volt az első bizonyíték arra, hogy a fehérjék meghatározott molekuláris mintával – tehát nem folyadékban lévő véletlenszerű szerkezettel – rendelkező anyagok. Sanger sikere a röntgenkrisztallográfia művelőire, például Watsonra és Crickre is kihatott, akik ekkor más a fehérjék keletkezésének DNS általi irányítását kutatták. Sanger 1954. októberi előadásai után Crick a DNS-ben lévő nukleotidok elrendezése és az aminosavak szekvenciája közti összefüggés elméletét írta le, ami meghatározta a fehérjék funkcióinak megértését is. Elméletét 1958-ban közölte.
RNS-szekvenálás
Az RNS-szekvenálás a nukleinsav-szekvenálás egyik első változata volt. Fő eredménye az első teljes gén és az MS2 fág teljes genomjának szekvenálása, melyet Walter Fiers és társai tettek közzé a Genti Egyetemen 1972-ben és 1976-ban. A hagyományos RNS-szekvenálási módszerek komplementer DNS készítését és annak szekvenálását igényelték. Korai DNS-szekvenálási eljárások A DNS-szekvencia-meghatározás első módszere helyspecifikus primerbővítést tartalmazott, melyet a Cornell Egyetemen Ray Wu fejlesztett ki 1970-ben. A DNS-polimeráz-katalízist és a specifikus nukleotidjelölést, melyek jelentős mértékben megtalálhatók mai szekvenálási eljárásokban is, már ekkor használatosak voltak a lambda-fág-DNS kohéziós végei szekvenálására. 1970 és 1972 között Radha Padmanabhan kimutatták, hogy e módszer használható bármely DNS-szekvencia meghatározására szintetikus helyspecifikus primerekkel.
Walter Gilbert, biokémikus és Allan Maxam, molekuláris genetikus a Harvard Egyetemen szintén kidolgoztak szekvenáló eljárásokat, például egyet „kémiai bontásos DNS-szekvenálásra”. 1973-ban Gilbert és Maxam beszámoltak vándorló helyes elemzéssel szekvenált 24 bázispáros szakaszról. A szekvenálás előrehaladását segítette a rekombináns DNS-technológia egyidejű fejlődése, mely lehetővé teszi a nem vírusokból történő DNS-izolációt.
2 évvel később, 1975-ben Frederick Sanger, biokémikus és Alan Coulson, genomikus DNS-szekvenáló módszert alkottak meg. A „plusz-mínusz” módszernek is nevezett Sanger-szekvenálásban a DNS minden része érintett, de a 4 bázis egyikének reakciója nem szerepelt benne.
1976-ban Gilbert és Maxam a Harvard Egyetemen gyors DNS-szekvenáló módszert fedeztek fel, a Maxam–Gilbert-szekvenálást. A módszer a radioaktívan jelült DNS-t keémiailag kezeli, és a szekvencia meghatározásra használt poliakrilamid gélt használja.
1977-ben Sanger primerbővítő módszert alkotott a gyorsabb DNS-szekvenálás fejlesztésére a cambridge-i Medical Research Council-központon. A módszer hasonlított a „plusz-mínusz” módszerhez, azonban a láncvégi didezoxinukleotidok DNS-polimeráz általi szelektív beépítésén alapul az in vitro DNS-replikáció során. Sanger módszerét ugyanez évben közölte. Teljesgenom-szekvenálás bélyegkép|300px|A φX174 fág -os genomja. Minden színezett részlet génnek felel meg. Az első teljesen szekvenált DNS-genom a φX174 fágé volt, melyet 1977-ben szekvenáltak. A Medical Research Council tudósai határozták meg először az Epstein–Barr-vírus DNS-ét 1984-ben, melyet nukleotidosnak találtak. Ez fordulópontnak bizonyult a DNS-szekvenálásban, mivel a vírus genetikai profilja korábbi ismerete nélkül történt.