La terapia genica è la modifica e la manipolazione dell'espressione genica delle cellule al fine di poter curare delle patologie (es. malattie genetiche). Fu concepita a seguito del grande progresso delle metodiche di biologia molecolare e ingegneria genetica sviluppatesi a partire dagli anni ottanta. Tali tecniche consentirono il clonaggio ed il sequenziamento di vari geni. Ciò comportò la precisa identificazione di molte alterazioni geniche in diverse patologie e la capacità, grazie alle tecniche del DNA ricombinante, di modificare microorganismi (come batteri o funghi) per poter far loro esprimere delle molecole d'interesse.
In particolare la terapia genica si propone di curare una patologia causata dall'assenza o dal difetto di uno o più geni (mutati) con la sostituzione con una variante "sana". Dunque, è necessario in primo luogo identificare il singolo gene o i diversi geni responsabili della malattia genetica. Sebbene le terapie siano generalmente sperimentali, si può tentare in secondo luogo - almeno per alcune malattie - la sostituzione dei geni malati sfruttando, ad esempio, come vettore un virus reso inattivo, svuotato preventivamente del suo corredo genetico. Con un meccanismo piuttosto complesso, che richiede l'uso di 'forbici' molecolari enzimatiche, enzimi di restrizione (con cui si preleva il gene "sano") si può poi 'correggere' il DNA, rimpiazzando le sequenze difettose, in modo tale che la cellula sintetizzi correttamente le proteine necessarie al corretto funzionamento metabolico.
Il passo successivo consistette nella valutazione della possibilità di trasfettare le cellule somatiche di un individuo avente una malattia genetica con un segmento di DNA contenente l'allele sano. Questo approccio si è successivamente esteso anche alle patologie non mendeliane come tumori, infezione da HIV ed altre patologie in cui non si va a sostituire un gene difettoso ma se ne aggiunge uno che possa mettere in moto un fenomeno terapeuticamente utile.
Storia I primi accenni sull'utilizzo dei geni nel trattamento delle malattie risalgono agli anni settanta. Nel 1972 fu pubblicato su Science un articolo di Friedmann e Roblin intitolato Gene therapy for human genetic disease? ("terapia genica per le malattie genetiche umane?"), ma già nel 1970 Rogers aveva proposto l'uso di DNA esogeno "buono" per sostituire quello non funzionante e causa di determinate malattie genetiche.
Nel 1990 William French Anderson realizzò con successo la prima terapia genica applicata a un essere umano, una bambina affetta da SCID.
Tipologie di terapia genica Esistono due tipologie di terapia genica: quella delle cellule germinali e quella delle cellule somatiche.
La prima si propone di trasfettare le cellule della linea germinale come spermatozoi ed ovociti o le cellule staminali totipotenti dei primissimi stadi dello sviluppo dell'embrione (alla fase di 4-8 cellule), ma attualmente essa non viene messa in pratica sia per ragioni tecniche e, soprattutto, per i grandissimi dilemmi etici che solleva.
La seconda tipologia, invece, si propone di modificare solamente le cellule somatiche, senza intaccare, quindi, la linea germinale; oggigiorno è la via più studiata e tentata. La terapia genica delle cellule somatiche, a sua volta, viene suddivisa in due gruppi: la terapia genica ex vivo e quella in vivo.
La terapia genica ex vivo È la tipologia che venne messa in pratica per prima e consiste nel prelievo delle cellule somatiche della persona interessata. Esse, successivamente, vengono messe in coltura in laboratorio. Durante questo tempo vengono anche trasdotte con il gene d'interesse, inserito tramite un apposito vettore (spesso vengono usati vettori virali), e successivamente vengono reinfuse o reimpiantate nel corpo del soggetto. Tale procedura è sicuramente la più lunga e la più costosa delle due ma permette di selezionare ed amplificare le cellule d'interesse ed inoltre gode d'una maggior efficienza.
È attualmente la modalità più utilizzata ma è riservata solamente a quei casi in cui sia possibile prelevare, mettere le cellule in cultura e reinserirle nell'organismo.
La terapia genica in vivo Viene attuata in tutti quei casi in cui le cellule non possono essere messe in coltura, o prelevate e reimpiantate, come quelle del cervello o del cuore e della maggior parte degli organi interni; inoltre, rappresenta un modello terapeutico con elevata ottemperanza e molto economico ma, attualmente, di più difficile applicazione. In questo caso il gene, o l'oligonucleotide d'interesse viene inserito nell'organismo, tramite un opportuno vettore, direttamente per via locale o sistemica. I sistemi attualmente studiati sono di tre tipi: lipoplessi, poliplessi, lipopoliplessi. Questi, si formano attraverso l'interazione elettrostatica sussistente tra il DNA (carico negativamente) e nanoparticelle (cariche positivamente). Le nanoparticelle possono essere rispettivamente di tipo lipidiche (liposomi cationici), polimeriche (policationi), o un sistema supramolecolare formato da liposomi e policationi. Potenzialmente tutti i tre tipi di vettori non virali potrebbero sostituire gli attuali vettori virali e fisici.
Terapia genica in utero La terapia genica in utero richiede una diagnosi precoce e ha come rischi infezioni, parto prematuro o lesioni fetali. L'ambizione di questa terapia è quella di correggere le mutazioni geniche fetali primaché diventino irreversibili, quali: malattie mitocondriali gravi, malattie neurodegenerative come l’Atrofia muscolare spinale (Sma) tipo 1, distrofie muscolari congenite, malattia di Wilson, malattie polmonari congenite, come le sindromi da deficit di surfattante.
La prima tappa Affinché la terapia genica possa venir eseguita è necessario conoscere la fisiopatologia della malattia in questione ed identificare gli eventuali geni alterati o coinvolti nel processo o quelli terapeutici. Le metodiche di biologia molecolare e di genetica permettono di ottenere questi risultati in tempi sicuramente più rapidi rispetto al passato. Una volta individuato il gene d'interesse esso viene amplificato, clonato e sequenziato.
In tal modo risulta possibile raccogliere tutte le informazioni necessarie per comprendere la sua funzione e le sue possibilità d'utilizzo.
Tipologie di trasferimento Una volta che il gene d'interesse viene inserito nella cellula può accadere che esso vada incontro ad integrazione nel genoma cellulare oppure che rimanga esterno formando una particella episomale.
L'integrazione nel genoma permette la replicazione del gene ed il suo trasferimento alle cellule figlie derivanti dalla duplicazione della cellula madre.
La particella episomiale, invece, non viene interessata dalla duplicazione per cui essa non viene trasmessa alle cellule figlie. È possibile ovviare a questa situazione, comunque, associando al gene terapeutico un'origine di replicazione, una sequenza di DNA che permette l'aggancio delle polimerasi cellulari, che fa sì che l'episoma venga trasmesso alle cellule figlie.
Queste tre tipologie di trasferimento possono risultare utili nel trattamento di differenti patologie. Avendo a che fare con malattie genetiche, infatti, bisogna utilizzare un gene che si replichi in maniera stabile per cui lo si deve far integrare nel genoma dell'ospite (per esempio utilizzando un retrovirus) oppure lo si può inserire sotto forma di particella episomiale contenente un'origine di replicazione.
In altri casi, invece, il gene terapeutico è necessario solo per un certo periodo di tempo per cui lo si può aggiungere sotto forma di particella episomiale priva dell'origine di replicazione.
Metodologia del trasferimento genico La parte decisiva della terapia genica consiste nel metodo da adottare per effettuare il trasferimento del gene terapeutico (trasfezione). I diversi sistemi utilizzati per realizzare questo processo vengono attualmente distinti in virali e non virali.
Il trasferimento non virale Le metodologie adottate per trasferire il DNA senza ricorrere a virus comprendono: l'iniezione di DNA nudo, l'inserimento tramite liposomi, l'inserimento attraverso l'uso di polimeri cationici od il bombardamento tramite particelle (gene gun).
L'iniezione di DNA nudo è la procedura più lineare e più semplice ed inoltre permette di trasferire costrutti genici di grandi dimensioni. Consiste nell'iniettare il gene terapeutico, legato ad un plasmide, direttamente nella cellula tramite l'utilizzo d'una micropipetta. Lo svantaggio di questa metodica consiste nel fatto che bisogna iniettare il DNA in ogni cellula, una per una. Il rendimento, inoltre, è decisamente basso.
I liposomi sono vescicole sferiche la cui parete è composta da un doppio strato fosfolipidico. Usando liposomi cationici è possibile far complessare ad essi il DNA, che a pH neutro presenta carica negativa. Il complesso DNA-liposoma può fondersi con la membrana cellulare ma nella maggior parte dei casi viene internalizzato tramite endocitosi. Successivamente il DNA viene liberato nel citoplasma, entra nel nucleo e viene espresso. Sfortunatamente questo processo è a bassa efficienza in quanto si è visto che solo lo 0,1% del DNA introdotto viene espresso. Per ovviare a ciò nei liposomi sono state anche inserite proteine ed anticorpi che possano aumentare l'efficacia della procedura minimizzando la degradazione del DNA e facilitando il corretto direzionamento della vescicola.
Molto simile è la procedura che si applica per la transfezione che utilizza polimeri cationici, infatti polimeri dotati di molteplici cariche positive interagiscono con il DNA, che, come già detto, a pH fisiologico è un polianione, provocandone la condensazione e proteggendolo da aggressivi sia chimici che enzimatici, oltre che da radiazioni ionizzanti. Anche i complessi DNA-policatione vengono internalizzati dalla cellula per endocitosi, e possono essere attivamente indirizzati verso specifiche linee cellulari o tessuti utilizzando anticorpi o altre molecole direzionanti.
Il quarto metodo consiste nell'utilizzo di particolari strumenti elettrici o ad alta pressione, dette pistole geniche (gene gun), che permettono di inviare nella cellula microscopiche particelle d'oro o di tungsteno ricoperte di DNA. Al momento esistono studi su modelli animali ma non sull'uomo.
Il trasferimento virale Si basa sull'utilizzo di opportuni virus ricombinanti.
I virus hanno un'ottima tendenza ad infettare le cellule e ad inserirvi il proprio DNA sia integrandolo sia sotto forma d'episoma. Rispetto ai sistemi di trasferimento non virali, quindi, hanno un'efficienza nettamente maggiore. I virus da impiegare, tuttavia, devono godere d'alcune caratteristiche: le particelle virali ricombinanti, rispetto al wild-type (tipo selvaggio cioè il virus non ricombinato), devono essere difettive rispetto alla replicazione il virus non deve possedere alcune qualità non desiderabili (come la produzione di composti tossici o l'attivazione del sistema immunitario) vi dev'essere spazio a sufficienza per il gene terapeutico (vincolo di dimensione).
I virus attualmente studiati quali vettori per la terapia genica sono: i retrovirus, i lentivirus, gli adenovirus, i virus adenoassociati, gli herpesvirus.
I retrovirus