Uma FLAG-tag, FLAG octapeptídeo ou epítopo FLAG é um peptídeo que funciona como uma etiqueta proteica que pode ser adicionada a uma proteína utilizando a tecnologia de DNA recombinante, tendo a sequência DYKDDDDK (onde D=ácido aspártico, Y=tirosina e K=lisina). É uma das etiquetas mais específicas e é um antigénio artificial para o qual foram desenvolvidos anticorpos monoclonais específicos de alta afinidade e, por isso, podem ser utilizados para a purificação de proteínas por cromatografia de afinidade e também para a localização de proteínas no interior de células vivas. A sequência FLAG tem sido utilizada para separar proteínas recombinantes sobre-expressas da proteína de tipo selvagem expressa pelo organismo hospedeiro. A sequência FLAG pode também ser utilizada no isolamento de complexos proteicos com múltiplas subunidades, uma vez que o processo de decomposição suave da sequência FLAG tende a não distorcer tais complexos. A purificação baseada em FLAG tem sido utilizada para obter proteínas com pureza e qualidade suficientes para a determinação da estrutura tridimensional por cristalografia de raios X.
A sequência FLAG pode ser utilizada em diversos tipos de bioensaios que requerem reconhecimento por um anticorpo. No caso de não existirem anticorpos disponíveis contra uma determinada proteína, a adição de uma etiqueta FLAG permite que a proteína seja estudada com um anticorpo contra a sequência da etiqueta FLAG. Exemplos incluem estudos de localização celular por imunofluorescência, imunoprecipitação ou deteção por eletroforese de proteínas SDS-PAGE e Western blotting.
A sequência peptídica de uma etiqueta FLAG, do terminal N ao terminal C, é: DYKDDDDK (1012 Da). Além disso, as etiquetas FLAG podem ser utilizadas em tandem, tipicamente o peptídeo 3xFLAG: DYKDHD-G-DYKDHD-I-DYKDDDDK (com a etiqueta final a codificar um local de clivagem da enterocinase). A etiqueta FLAG pode ser fusionada ao terminal C ou N de uma proteína ou inserida numa proteína. Alguns anticorpos comercialmente disponíveis (por exemplo, M1/4E11) reconhecem o epítopo apenas quando a etiqueta FLAG está presente na extremidade N-terminal. No entanto, outros anticorpos disponíveis (por exemplo, M2) são insensíveis à posição. O resíduo de tirosina na etiqueta FLAG pode sofrer sulfatação quando expresso em certas proteínas secretadas, o que pode afetar o reconhecimento do epítopo FLAG pelo anticorpo. A etiqueta FLAG pode ser utilizada em conjunto com outras etiquetas de afinidade, por exemplo, uma etiqueta de poli-histidina (His-tag), HA-tag ou myc-tag).
Histórico
A primeira utilização da marcação com epítopos foi descrita por Munro e Pelham em 1984. A etiqueta FLAG foi o segundo exemplo de uma etiqueta de epítopo melhorada e totalmente funcional publicada na literatura científica. e era a única etiqueta de epítopo patenteada.FLAG é uma marca registada de Sigma-Aldrich Co. LLC. US patent 4703004, Hopp, Thomas P; Bektesh, Susan & Conlon 3rd., Paul J et al., "Synthesis of protein with an identification peptide", published 1987-10-27, assigned to Immunex Corp. Desde então, tornou-se uma das etiquetas proteicas mais utilizadas em laboratórios de todo o mundo. Ao contrário de outras etiquetas (por exemplo, myc, HA), em que um anticorpo monoclonal contra uma proteína existente foi primeiro isolado e o epítopo foi então caracterizado e utilizado como etiqueta, o epítopo FLAG foi um desenho artificial idealizado, para o qual foram criados anticorpos monoclonais. A sequência da etiqueta FLAG foi otimizada para compatibilidade com as proteínas às quais se liga, dado que a etiqueta FLAG é mais hidrófila do que outras etiquetas de epítopo comuns e, portanto, menos propensa a reduzir a atividade das proteínas às quais a etiqueta FLAG está ligada. Além disso, as etiquetas FLAG N-terminais podem ser facilmente removidas das proteínas após o isolamento, por tratamento com a protease específica enterocinase (enteropeptidase).
O terceiro relato de etiqueta de epítopo (a etiqueta HA), surgiu cerca de um ano após o sistema FLAG.
Ver também Outros artigos Etiqueta proteica SpyTag
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