Em biologia molecular e biologia, um knock-in de genes (ou simplesmente knock-in) é um método de engenharia genética que envolve a substituição ponto a ponto de informação de sequência de ADN num locus genético ou a inserção de informação de sequência que não se encontrava nesse locus.
Normalmente, isto é feito em ratinhos, dado que a tecnologia para este processo é mais refinada neles e há um alto grau de complexidade de sequências partilhadas entre ratinhos e humanos. A diferença entre a tecnologia knock-in e as técnicas transgénicas tradicionais é que um knock-in afeta um gene num locus específico, sendo, por isso, uma inserção dirigida a um alvo.
Um uso comum da tecnologia knock-in é para a criação de modelos de doenças. É uma técnica graças à qual os investigadores podem estudar a função do mecanismo regulador (por exemplo, promotores) que governa a expressão do gene natural que está a ser substituído. Isto é realizado observando o novo fenótipo do organismo em questão. Utilizam-se BACs e YACs para que se possam transferir grandes fragmentos.
Técnica
O knock-in de genes originou-se como uma pequena modificação da técnica original do knockout desenvolvida por Martin Evans, Oliver Smithies e Mario Capecchi. Tradicionalmente, as técnicas knock-in fundamentavam-se na recombinação homóloga para dirigir a substituição do gene alvo, embora se tenham desenvolvido também outros métodos que usam um sistema mediado por transposões. As células estaminais embrionárias com a modificação de interesse são depois implantadas num blastocisto viável, que crescerá formando um ratinho quimérico maduro, no qual algumas células têm a informação genética das células do blastocisto original e outras células têm as modificações introduzidas nas células estaminais embrionárias. A descendência que esses ratinhos quiméricos tiverem terá o knock-in.
O knock-in de genes permitiu pela primeira vez fazer estudos baseados em hipóteses sobre modificações génicas e os fenótipos resultantes. Por exemplo, podem induzir-se mutações no gene humano p53 por exposição ao benzo(a)pireno (BaP), e a cópia mutada do gene p53 pode ser inserida em genomas de ratinho. Os tumores pulmonares observados nos ratinhos knock-in oferecem apoio à hipótese da carcinogenicidade do benzo(a)pireno (um componente do fumo do tabaco). Desenvolvimentos mais recentes nas técnicas knock-in permitiram incorporar nos porcos um gene da proteína fluorescente verde inserida com o sistema CRISPR/Cas9, que permite umas inserções génicas mais exatas e bem-sucedidas. A velocidade do knock-in de genes mediado por CRISPR/Cas9 também permite gerar modificações bialélicas nalguns genes e os fenótipos em ratinhos podem ser observados numa só geração, o que é uma curta escala de tempo sem precedentes.
Comparação com o knockout de genes
A tecnologia knock-in é distinta da knockout porque a tecnologia knockout trata de eliminar por deleção parte da sequência de ADN ou inserir informação de sequência de ADN irrelevante para interromper a expressão de um locus genético específico. A tecnologia knock-in, por outro lado, altera o locus genético de interesse por meio de uma substituição ponto a ponto da informação de sequência de ADN ou pela adição de informação de sequência que não se encontrava nesse locus genético. Um knock-in, portanto, pode ser considerado em geral uma mutação de ganho de função e um knockout uma mutação de perda de função, mas um knock-in de genes pode também implicar a substituição de um locus génico funcional por um fenótipo mutante que tem como resultado alguma perda de função.
Possíveis aplicações
Devido ao sucesso que os métodos de knock-in estão a ter, podem ser pensadas muitas aplicações clínicas para eles. O knock-in de secções de um gene de imunoglobulina humana em ratinhos já permitiu que estes animais produzam anticorpos humanizados que são úteis terapeuticamente. Deveria ser possível modificar células estaminais em humanos para restaurar a função de um gene alvo em certos tecidos, por exemplo a possível correção do gene mutante da cadeia gama do Recetor de IL-2 em células estaminais hematopoéticas para restaurar o desenvolvimento dos linfócitos em pessoas com imunodeficiência combinada grave ligada ao X.
Limitações
Ainda que a tecnologia do knock-in tenha demonstrado ser poderosa para a geração de modelos de doenças humanas e estudo de proteínas in vivo, existem ainda numerosas limitações. Muitas destas são as mesmas que tem a tecnologia knockout. Primeiro, as combinações de genes knock-in levam a um aumento da complexidade nas interações que os genes inseridos e os seus produtos têm com outras secções do genoma e podem, portanto, conduzir à aparição de mais efeitos colaterais e fenótipos difíceis de explicar. Além disso, só foram suficientemente bem caracterizados uns poucos *loci*, como o locus ROSA26, onde podem ser utilizados para o knock-in de genes condicional; tornando problemáticas as combinações de gene repórter e transgenes no mesmo locus. As maiores desvantagens de usar o knock-in de genes em doenças humanas para gerar modelos é que a fisiologia dos ratinhos não é idêntica à humana e as proteínas ortólogas humanas expressas em ratinhos tendem a não refletir totalmente o papel de um gene na patologia humana. Isto pode ser observado em ratinhos produzidos com a mutação da fibrose cística ΔF508 no gene CFTR, que explica mais de 70 % das mutações neste gene na população humana e origina fibrose cística. Embora os ratinhos ΔF508 CF mostrem as características de defeitos de processamento próprias da mutação humana, não apresentam as alterações na fisiopatologia pulmonar que se observam em humanos e não apresentam virtualmente nenhum fenótipo pulmonar. Estes problemas podem ser mitigados com o uso de diversos modelos animais, e foram criados modelos de porcos (os pulmões de porco têm muitas semelhanças bioquímicas e fisiológicas com os pulmões humanos) numa tentativa de explicar melhor a atividade da mutação ΔF508.
Notas
Categoria:DNA Categoria:Biologia molecular Categoria:Engenharia genética Categoria:Biotecnologia Categoria:Técnicas em biologia molecular Categoria:Expressão genética