miniaturadaimagem|(a) Seccionamento óptico em microscopia de fluorescência de um grão de pólen. (b) Imagem combinada dos múltiplos panos. (c) Imagem combinata para múltiplos grãos. O seccionamento óptico é o processo através do qual um microscópio produz imagens claras de diferentes planos focais de uma amostra. A técnica reduz a necessidade de cortes muito finos com micrótomo.
Um bom seccionamento óptico gera imagens com boa resolução em profundidade ou no eixo "z". A técnica é popular em estudos modernos de microscopia, pois permite a reconstrução tridimensional da amostra a partir dos múltiplos planos.
Seccionamento óptico em microscópios A resolução na direção da profundidade (a "resolução z") de um microscópio de campo amplo padrão depende da abertura numérica e do comprimento de onda da luz, podendo ser estimada por:
onde λ é o comprimento de onda, n o índice de refração do meio de imersão da lente objetiva e NA a abertura numérica.
Em comparação, a resolução lateral pode ser estimada como:
Microscopia de fluorescência Na microscopia de fluorescência, objetos fora do plano focal só interferem na imagem se forem iluminados e emitirem fluorescência. Isso torna possível o aprimoramento do seccionamento óptico, direcionando a iluminação apenas para o plano focal.
A técnica de microscopia confocal utiliza um ou mais pontos de luz para iluminar a amostra. Em conjunto com um orifício ("pinhole") em um plano focal conjugado, a técnica atua para filtrar a luz de fontes fora do plano focal, melhorando o seccionamento óptico.
A microscopia de fluorescência com lâminas de luz projeta uma luz de excitação em um ângulo de 90° em relação à direção de observação. Dessa forma, apenas o plano focal é iluminado usando um laser em forma de lâmina de luz). Este método reduz a luz que é enviada para áreas fora de foco, reduzindo a fototoxicidade e podendo levar a uma melhoria modesta na resolução longitudinal.
O seccionamento óptico de microscópios de campo amplo (wide field) pode ser melhorada significativamente por deconvolução, uma técnica de processamento de imagem que melhora a resolução da imagem de acordo com uma função de espalhamento de pontos (point spread function). Alternativas As principais alternativas ao seccionamento óptico são:
O corte fino da amostra, por exemplo, como usado em histologia . A tomografia, particularmente bem desenvolvida para a microscopia eletrônica de transmissão .
Referências
Categoria:Microscopia